保健食品中巴比妥類化學(xué)成分的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法

1、 附件3保健食品中巴比妥類化學(xué)成分的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法（征求意見(jiàn)稿）1 范圍本方法規(guī)定了保健食品中巴比妥類化學(xué)成分的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。本方法適用于硬膠囊、軟膠囊、丸劑、片劑、散劑及口服液等保健食品中巴比妥類化學(xué)成分的快速測(cè)定。2 原理本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的巴比妥類化學(xué)成分經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和檢測(cè)線（T線）上抗原的結(jié)合，從而致使檢測(cè)線不顯色。通過(guò)檢測(cè)線的顯色與否判讀，對(duì)樣品中巴比妥類化學(xué)成分進(jìn)行定性判定。3 試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 無(wú)水乙醇。3.1

2、.2 提取液：將無(wú)水乙醇（3.1.1）與水按照體積比10:90混勻。3.1.3 甲醇。3.2 參考物質(zhì)參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見(jiàn)表1，純度95%。表1 參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子量巴比妥Barbital57-44-3C8H12N2O3184.19苯巴比妥Phenobarbital50-06-6C12H12N2O3232.24異戊巴比妥Amobarbital57-43-2C11H18N2O3226.27司可巴比妥鈉Secobarbital76-73-3C12H17N2O3238.2

3、8注：或等同可溯源物質(zhì)。3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3.3.1 巴比妥類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.5 mg/mL）：精密稱取巴比妥（或苯巴比妥，異戊巴比妥，司可巴比妥鈉）標(biāo)準(zhǔn)品（3.2.1）適量，置于10mL容量瓶中，加入適量甲醇（3.1.3）超聲溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.5mg/mL的巴比妥類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。20 避光保存，有效期6個(gè)月。3.3.2 巴比妥類標(biāo)準(zhǔn)中間液（50g/mL）：精密量取巴比妥類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.5mg/mL）（3.3.1）1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為50g/mL的巴比妥類標(biāo)準(zhǔn)中間液。3.4材料免疫膠體金免疫層析試劑盒，適

4、用于保健食品硬膠囊、軟膠囊、丸劑、片劑、散劑及口服液。4 儀器和設(shè)備4.1天平：感量為0.01 g。4.2渦旋混合器。4.3移液器：200L4.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速4000r/min。4.5環(huán)境條件：溫度1535，濕度80%。5 分析步驟5.1試樣制備取適量樣品，硬膠囊及軟膠囊取內(nèi)容物充分混勻，丸劑及片劑充分粉碎混勻，散劑及口服液充分混勻。5.2試樣提取準(zhǔn)確稱取試樣2.0 g（精確至0.01g）于15mL具塞離心管中，加入10mL提取劑（3.1.2）。加蓋后振搖或渦旋振蕩0.5min，放置至澄清（30min內(nèi)）或4000r/min離心5min，取上清液作為待測(cè)液。5.3 測(cè)定步驟吸取200 L待測(cè)液

5、滴加到檢測(cè)卡（3.4.1.1）上的加樣孔中，開(kāi)始計(jì)時(shí)。38min內(nèi)觀察質(zhì)控線（C線）和檢測(cè)線（T線）的顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定。5.4 質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。5.4.1 空白試驗(yàn)稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取空白試樣（精確至0.01g）置于15mL具塞離心管中，加入一定體積的巴比妥類標(biāo)準(zhǔn)中間液（3.3.2），使巴比妥類化學(xué)成分添加濃度為：巴比妥40mg/kg（或苯巴比妥40mg/kg，異戊巴比妥60mg/kg，司可巴比妥鈉60mg/kg）。按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。6 結(jié)果判定通過(guò)對(duì)比控制線（C線）和檢

6、測(cè)線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視判定示意圖見(jiàn)圖1。6.1 無(wú)效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或檢測(cè)卡無(wú)效。6.2 陰性結(jié)果檢測(cè)線（T線）和控制線（C線）均顯色，表明樣品中巴比妥類化學(xué)成分低于方法檢測(cè)限，判定為陰性。6.3 陽(yáng)性結(jié)果檢測(cè)線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中巴比妥類化學(xué)成分的含量高于方法檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性。 陰性（-） 陽(yáng)性（） 無(wú)效圖1 檢測(cè)結(jié)果判讀6.4 質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。7 結(jié)論當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。8 性能指標(biāo)8.1 檢測(cè)限：巴比妥40mg/kg、苯巴比妥40mg/kg、異戊巴比妥6

7、0mg/kg、司可巴比妥鈉60mg/kg。8.2 靈敏度：靈敏度應(yīng)96%。8.3 特異性：特異性應(yīng)98%。8.4 假陰性率：假陰性率應(yīng)4%。8.5 假陽(yáng)性率：假陽(yáng)性率應(yīng)2%。8.6 相對(duì)準(zhǔn)確度：相對(duì)準(zhǔn)確度應(yīng)96%。注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A。9其他本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號(hào)2009024）和保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)BJS 201710。附錄

8、A定性方法性能計(jì)算表表A.1 性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測(cè)結(jié)果b總數(shù)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(c2)c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽(yáng)性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對(duì)準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列