免疫學(xué)基礎(chǔ)及試驗(yàn)技術(shù)修

1、免疫學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)修免疫學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名姚麗君專(zhuān)業(yè)針灸推拿學(xué)年級(jí)2002年研究生實(shí)驗(yàn)室免疫試驗(yàn)室 時(shí)間 2003年1月12日教師李永念老師免疫學(xué)教研室人血清I 的提取及鑒定一.主要原理（一）離子交換層析提取人 血清I gG離子交換劑采用 DEAE-纖維素，是表面交聯(lián)有二 乙基乙胺基團(tuán)的纖維素，本身帶有真電荷，能吸附陰離子。DEAE-纖維素懸浮在 PH高于6.5,克分子濃度低的緩沖 液內(nèi)，置備成層析柱。人血清經(jīng)過(guò) PH7.4磷酸緩沖液透析平衡后，其中的 IgG 不帶電荷或僅帶少量電荷，其他的蛋白質(zhì)則主要帶負(fù)電荷， 這樣的血清樣品通過(guò)相同緩沖液平衡好的DEAE-纖維素柱，除IgG以外

2、的血清蛋白都吸附在柱上，僅IgG最易形成吸附-解離-再吸附-再解離的狀態(tài)，因此能隨洗脫液一起最早從柱 中流由，收集洗脫液獲得 IgG o（二）血清I鑒定以收集的洗脫液為抗原， 與兔抗人IgG 做瓊脂雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)沉淀線的形成確定IgG抗原性。用免疫電泳法使血清中各種蛋白的分子大小以及電荷狀 態(tài)、電荷量均有差異，因而它們的泳動(dòng)速率也不相同，根據(jù) 在凹槽中加入免抗人血清，上下兩孔加入用蔗糖包埋法進(jìn)行 濃縮后的濃縮液和正常人血清，經(jīng)一段時(shí)間后由現(xiàn)沉淀弧， 根據(jù)沉淀弧的情況來(lái)檢測(cè)所獲的IgG的純度。用754型分光光度計(jì)于 280nm紫外光源測(cè)定洗脫液光密 度值，根據(jù)IgG的E1cm114.3OD公

3、式，可計(jì)算由收獲的IgG 含量，并推算由所獲得IgG的百分率。二. 主要材料 1. 0.5N NaOH、0.5N HCL、0.85NaCL 按常規(guī)配制 2. DEAE-纖維素 健康人全血 3. PH7.4 0.01M 磷酸緩沖液4. 20三氯醋酸水溶液按 W/V比例配制5.蔗 糖（研成細(xì)粉狀）6. PH8.6 0.025MBA巴比妥納-巴比妥緩沖液，2M NaCL水溶液7. 1.5瓊脂凝膠8.布氏漏斗、 抽濾瓶、水泵、試管，燒杯，玻璃棒，濾紙?jiān)嚰?、蝴蝶鐵架、 透析袋、離心機(jī)，746-電泳儀、754型分光光度計(jì)三、操作步驟（一）DEAE-纖維素預(yù)處理 1、稱(chēng)取DEAE- 纖維素12克，均勻撒在事

4、先盛有 150ml 0.5NNaOH的燒杯 中，人其自由沉降，放置4 0 - 5 0分鐘，不時(shí)地用玻璃棒 輕輕攪動(dòng)。2、將湖狀物移入墊有濾紙的布氏漏斗中，連接漏斗抽 濾瓶，并用水泵抽干糊狀物。立即將 DEAE-纖維素移入燒杯中，加蒸儲(chǔ)水，浸泡 20-30min并不時(shí)攪拌，再移入漏斗抽干，如此重復(fù)，至洗由 的PH值等于8即可。將交換劑移入 150ml 0.5N HCL中放置40-50min , 不時(shí)輕輕攪動(dòng)，移入布氏漏斗抽濾，再依同法用 0.5N NaOH 處理一次，時(shí)間不超過(guò) 50min。4、重第2項(xiàng)操作，至抽濾液 PH值等于8即可，最后PH7.4 0.01MPB液浸泡交換劑，抽干，再重復(fù)一次

5、，然后將 交換劑用相同PB調(diào)成糊狀，保留至裝柱。裝柱、平衡1、固定層析柱在蝴蝶鐵架上，垂 直。柱上方放置PH7.4 0.01MPB液的洗脫瓶，以乳膠管相連， 柱底部有細(xì)膠管，裝止水夾，調(diào)節(jié)流速。2、將上糊狀物傾入柱中，打開(kāi)柱底流由口，用燒杯接 流生液，注意不能斷層，纖維素中不允許進(jìn)空氣，柱上表面 要平，上部要留有約 3cm高空間。上樣和洗脫1、 將人血置離心機(jī)以 2000rpm, 10min離心，取由并用毛細(xì)吸管吸取10 ml人血清裝入透析袋,于燒杯內(nèi)浸入40倍于血清體積的起始緩沖液中，置4 C冰箱內(nèi)透析過(guò)夜，中途更換兩次緩沖液；2、打開(kāi)柱上端塞子，用帶有橡皮乳頭的毛細(xì)吸管吸由交換劑表面的緩沖

6、液， 至仍2mm厚的液面，以免空氣進(jìn)入；3、用清潔細(xì)吸管將已 平衡好的血清樣本原柱管內(nèi)壁緩緩加在纖維素柱表面，調(diào)節(jié) 流速，使樣品進(jìn)入交換柱內(nèi)，約 3ml/10min; 4、待液面還約 2mm厚的樣品時(shí)，用少量起始 PB沖洗柱內(nèi)壁，到 PB進(jìn)入 交換劑仍留有2mm后液面時(shí)，再?zèng)_洗二次，保持柱面平整；5、 最后加適量起始緩沖液，連接洗脫瓶，流速調(diào)至 30-40ml/cm2/h ; 6、收集洗脫液與試管中，每管 5ml,共收集12管并從各管中取1-2滴，力口 20三氯醋酸1-2滴檢測(cè)。洗脫液抗原性鑒定 1、用1.5瓊脂凝膠制版， 根據(jù)下圖用打孔器打孔 2、加樣中心孔加入兔抗人IgG,從 收集的12管

7、洗脫液中用毛細(xì)吸管吸取洗脫液分別加入周?chē)?六孔，每孔所加樣品的量以液面與孔測(cè)平齊為準(zhǔn)；3、將瓊脂板置濕盒內(nèi)37 c溫箱孵育24小時(shí)，觀察結(jié)果。（五）IgG純度鑒定1、瓊脂板制作用1. 5瓊脂凝膠 加熱融化后傾注在載玻片上，玻片上放一條細(xì)玻棒，等凝膠 凝固后在玻棒上下兩側(cè)打孔，制成如圖所示2、洗脫液的處理將通過(guò)離子交換層析法收集的12管洗脫液，用754型分光光度計(jì)測(cè)各管洗脫液在波長(zhǎng)280nm的光密度值，第一個(gè)蛋白峰為IgG,收集有IgG活性的三管洗脫液，混合后裝于 透析袋內(nèi)，用蔗糖粉末將其包埋使其濃縮；3、加樣如圖示上孔加入濃縮的IgG提取液，下孔加入正常人血清，將加 樣后的瓊脂板置于 746-

8、電泳儀上，用四層紗布條做橋，連接 凝膠板與電極緩沖液。該橋搭在凝膠上部分約 5mm ,盡量拉直，與膠面間不能 有氣泡；4、連接電源，調(diào)節(jié)指示電壓至100V （端壓約為5V/cm）,電泳槽加蓋后，電泳至血清蛋白遷移至距正極段邊 緣1cm處，關(guān)閉電源； 5、凝膠板與桌面，取由玻條，凝 膠中部既成一長(zhǎng)槽，加兔抗人全血清加入槽內(nèi)與膠面水平；6、置凝膠板與濕盒內(nèi)，于37c或室溫中孵育，12小時(shí)觀察沉淀弧由現(xiàn)的情況。7、計(jì)算回收率取透析袋內(nèi)濃縮的提取液，用 754型分 光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)280的光密度值，如果超生測(cè)定范圍，稀釋 后再測(cè)，按濃縮后IgGmg/mlOD2801.43回收體積，正常人血 清IgG12

9、mg/ml收集的血清體積，回收率濃縮IgG/正常人血清IgG ,計(jì)算回收率。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、DEAE-纖維素洗脫，收集洗脫液12管, 均為略帶黃色的液體，取樣添加20三氯醋酸，各管中僅第4、 5管由現(xiàn)渾濁，表明試管洗脫液中含蛋白質(zhì)。其余管未見(jiàn)明顯反應(yīng)。2、745型分光光度計(jì)測(cè)由12管洗脫液的光密度 （OD） 值如下 管數(shù) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A280 0.024 0.032 2.85 3.04 2.65 0.66 0.192 0.155 0.133 0.113 0.110 0.110 做 A280 光 密度值峰值曲線圖如下A280 （試管數(shù)）a經(jīng)過(guò)蔗糖粉末包埋

10、后，收集到濃縮的IgG為3.5ml,測(cè)其OD值為3.52, 此值已經(jīng)超生光密度計(jì)測(cè)定范圍，取 0。5ml濃縮液加2.5ml生理鹽水稀釋5倍后測(cè)OD值為2.52。b按下列方法計(jì)算IgG 回收率 濃縮后 IgGCmg/mlOD2801.43 體積（3. 55）正常人血清 IgG12mg/ml 體積8ml回收率濃縮IgG/正常人血清IgG 2.521.433.55/12865.69 3、向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果如下圖，有白色成沉淀線由 現(xiàn)，彼此相互融合相連。4、疫電泳（純度鑒定）如下圖，有沉淀弧由現(xiàn)，提取 液與抗人全血清之間只由現(xiàn)一條沉淀弧，并靠近凝膠板負(fù)極 端，說(shuō)明所提取IgG為純品。人血清與抗人血清之

11、間由于存在多抗原抗體成分，所以 由現(xiàn)多條沉淀弧。五、分析與討論IgG是一種具有抗體活性的免疫球蛋白， 其具有一般蛋白質(zhì)的通性，是再次體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要 Ig。IgG主要由脾臟和淋巴結(jié)中漿細(xì)胞合成，含量高（在血清中含量最高），分布廣，它能與抗原特異性結(jié)合，從而在體 內(nèi)介導(dǎo)多種生理和病理效應(yīng)。本次試驗(yàn)是利用離子交換劑的特性，血清中IgG不帶電荷或僅帶少量電荷，其它的蛋白質(zhì)則主要帶負(fù)電荷，使人血 清通過(guò)帶陽(yáng)離子 DEAE-纖維素制成的交換劑，帶負(fù)電荷的蛋 白質(zhì)與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合，而不帶電荷的IgG處于游離狀態(tài)， 用PH7.4的磷酸緩沖液通過(guò)層析柱， 未結(jié)合的IgG隨洗脫液 一起流由，試管收集，這

12、樣使血清樣品通過(guò) DEAE-纖維柱而 得以分離由IgG。收集的洗脫液顏色略帶黃色，可能是收集血清時(shí)吸入了 破碎的紅細(xì)胞。在加入三氯醋酸后4、5管由現(xiàn)沉淀，說(shuō)明從第 4管開(kāi)始 有大量的IgG存在，IgG峰值集中在3、4、5三管，并峰值 上升和下降很快，未見(jiàn)饅頭峰，證明洗脫較好。本次試驗(yàn)已成功地收集了IgG。從雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果看，中間孔抗人IgG與周?chē)椎奶崛∫篒gG之間的凝膠由現(xiàn)一條白色沉淀線， 3、4、5 孔之間形成的沉淀線相互吻合，這說(shuō)明 IgG與抗體抗人IgG 濃度相當(dāng)，提取液為單一抗原，即 IgG。通過(guò)免疫電泳結(jié)果看在滴加濃縮提取液的一測(cè)由現(xiàn)一條 沉淀弧，說(shuō)明濃縮提取液中只有一種抗

13、原物質(zhì)，而在滴加正 常人血清的一測(cè)由現(xiàn)多條沉淀弧，說(shuō)明正常人血清中存在多 種抗原物質(zhì)。所以，通過(guò)以上兩個(gè)試驗(yàn)證明經(jīng)分離提取的為純IgG。根據(jù)回收率看本實(shí)驗(yàn)的提取及回收比較有效，亦可根據(jù)公式計(jì)算IgG的濃度為18.018mg/ml。實(shí)驗(yàn)七抗體形成細(xì)胞的檢測(cè)一、脾細(xì)胞介導(dǎo)的羊紅細(xì)胞分光光度計(jì)定量測(cè)定法(QHS)二、主要原理將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾臟制成細(xì)胞 懸液，與一定量的綿羊紅細(xì)胞在試管內(nèi)混合，加入適量補(bǔ)體，在水浴中孵育一定時(shí)間，在補(bǔ)體的參與下，引起抗體形成細(xì)胞周?chē)木d羊紅細(xì)胞溶解，而且溶血的程度與脾細(xì)胞中的抗 體形成細(xì)胞總數(shù)有一定的關(guān)系，與抗體形成細(xì)胞所分泌的抗 體量有關(guān)，但不能反映單個(gè)抗體

14、分泌細(xì)胞的數(shù)量。因抗體形成細(xì)胞上有抗綿羊紅細(xì)胞抗體，與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，在補(bǔ)體的激活下，綿羊紅細(xì)胞溶解，故抗 SRBC抗體 又稱(chēng)溶血素。通過(guò)一定量SRBC完全溶解的最高血清稀釋度得到溶血 素的效價(jià)。QHS法可用于檢測(cè)藥物對(duì) SRBC誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生過(guò)程是否 有刺激作用和抑制作用。三、主要材料1、 SRBC保存液，預(yù)先洗三次，配置為 0.5、1濃度的SRBC 2、Balb/c小鼠（體重25左右，雌雄隨 機(jī)），免疫與未免疫小鼠各 6只3、0.01M PH7.2 PBS （含Ca2, Mg2）,生理鹽水 4、補(bǔ)體（預(yù)先制備好的，需稀釋 成130）,熒光標(biāo)記的免疫小鼠IgG 5、其他水浴箱、離心機(jī)、 試管、

15、玻片、毛細(xì)吸管、組織研磨器等四、操作步驟 1、先摘除免疫小鼠的眼球，收集血液于 清潔干燥試管內(nèi)，待血液凝固后，置恒溫箱37c內(nèi)30min,血清析生，并收集與小管保存，以備測(cè)溶血素；2、頸椎脫臼處死小鼠，暴露腹腔，用 PBS清洗，用組織研磨器研磨置備單細(xì)胞懸浮液（每個(gè)脾臟加5mlNS）,然后離心（2000轉(zhuǎn)/分）10min,棄上清夜，再加生理鹽水離心，如此重復(fù) 3次， 各管最后留下的沉淀分別加生理鹽水至8ml備用；3、取6個(gè)試管，設(shè)1、2、5號(hào)為免疫后的小鼠，3號(hào)為未免疫小鼠，4、6號(hào)不裝入脾細(xì)胞，然后按如下操作，混勻，置 37 c水 浴箱30min ,目測(cè)結(jié)果如下 單位（ml）編號(hào) 脾細(xì)胞（5

16、106） /ml SRBC （0.5） 補(bǔ)體（130） PBC 目測(cè)結(jié)果 1-2 1 （免疫 鼠）1 1清3 1 （未免疫鼠）1 1 混濁4 1 1 1混濁5 1（免疫鼠）11混濁6 1 2混濁4、溶血素效價(jià)的測(cè)定1取前血清制備測(cè)血清，離心； 2取前制備免疫小鼠，取0.1ml于第一試管中，再加入0.9NS 1ml,混勻從中取0.5ml 加入第二個(gè)試管中，再加 0.5mlNS,混勻，取0.5ml加入第 三管中，繼續(xù)如此加至第 9管，稀釋后取由0.5ml丟棄，最后一管只加NS,然后再于各管中加入 0.5ml補(bǔ)體（130）和 0.5ml 1SRBC,搖勻，于37c水溶30min ,取由后看結(jié)果。方法

17、與結(jié)果如下 管數(shù)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 對(duì)照組 小鼠血清 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 - NS 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 補(bǔ)體 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 1RBC 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5結(jié)果血清稀釋度 110 120 140 1801160 1320 1640 11280 12560注完全溶血用完全不溶血3依同樣方法做未免疫小鼠各 10管，其結(jié)果為完全不溶血，液體混濁五、討論與分析 脾細(xì)胞介導(dǎo)的綿羊紅細(xì)胞分光光度計(jì)定 量測(cè)定法運(yùn)用了細(xì)胞溶血反應(yīng)來(lái)檢測(cè)溶血的程度與抗體形 成細(xì)胞總數(shù)及所分泌抗體量的關(guān)系?？乖涂贵w結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，抗體較鏈區(qū)構(gòu)型 改變，使Fc段的補(bǔ)體結(jié)合部位暴露，補(bǔ)體 C1與之結(jié)合，通 過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，形成攻膜復(fù)合體，并在細(xì)胞膜上 形成小孔，使小的可溶分子、離子