基于免疫膠體金標記技術(shù)的檢測研究及其在堆肥中的應(yīng)用展望

1、基于免疫膠體金標記技術(shù)的檢測研究及其在堆肥中的應(yīng)用展望【摘要】金納米顆粒作為一種性能優(yōu)異的標記物應(yīng)用廣泛。隨后開展出來的免疫膠體金標記技術(shù)作為一種靈敏度高、操作步驟簡便、檢測快速的免疫反響檢測技術(shù)得到廣泛關(guān)注。本文介紹了免疫膠體金標記技術(shù)的根本原理、制備方法并詳述了近年來該技術(shù)的新開展。此外，結(jié)合免疫膠體金標記技術(shù)在免疫檢測與環(huán)境檢測實際工作中的應(yīng)用，展望了其在堆肥環(huán)境檢測中的應(yīng)用潛力和開展前景。【關(guān)鍵詞】膠體金；標記；免疫檢測；堆肥;評述abstratldnanpartilehasbeenidelyusedasagdlabelingsubstane.subsequently,inreasin

2、gnernhasbeenpaidtiungldlabelingtehniquehihhashighsensitivity,siplepredureandrapiddetetininiunassay.hebasipriniple,preparatinethdsandiprtantdevelpentsfiungldlabelingtehniqueereintrduedinthisartile.inadditin,theneappliatinsandprspetsfiungldlabelingtehniqueinpstdetetinereprpsedbasedntheappliatinsiniuna

3、ssayandenvirnentalanalysis.keyrdsllidalgld;labeling;iunassay;psting;revie1引言堆肥被認為是將固體廢物減量化、資源化的最正確途徑1。研究建立有效而實用的原位、在體、實時、高靈敏度、高選擇性的分析檢測方法，用于檢測與控制堆肥過程中生物組分及污染物，這是堆肥研究中的關(guān)鍵技術(shù)。傳統(tǒng)的堆肥分析檢測方法常需要繁雜、冗長的萃娶提純、濃縮、色譜別離等步驟，而且試劑用量大，費用高2。免疫膠體金標記技術(shù)是以膠體金為示蹤標記物，應(yīng)用于特異性抗原抗體反響的一種新型免疫標記技術(shù)。膠體金具有納米材料所特有的三大效應(yīng)：外表效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧

4、道效應(yīng)，具有很大的比外表積，獨特的光學、導電、導熱等物理特性以及良好的生物相容性35，可以與蛋白質(zhì)、核酸等非共價結(jié)合，且檢測不依賴昂貴的激光檢測儀器，只需普通光學儀器，甚至肉眼可辨。另外免疫膠體金標記技術(shù)具有制作方便、價格低廉、容易操作、無放射性污染等優(yōu)點，滿足了現(xiàn)場快速環(huán)境檢測及實時監(jiān)測等方面的要求。但是該技術(shù)在環(huán)境污染治理領(lǐng)域，特別是堆肥環(huán)境檢測的應(yīng)用起步較晚，相關(guān)報道較少。本文通過評述免疫膠體金標記技術(shù)近年來的新開展及實際應(yīng)用情況，特別是在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用進展來展望其在堆肥環(huán)境檢測中的應(yīng)用前景。2免疫膠體金標記技術(shù)的研究現(xiàn)狀2.1膠體金標記原理與制備膠體金是氯金酸在復(fù)原劑的作用下，聚合成特

5、定大小的金顆粒，并由于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱之為膠體金6。在堿性條件下，膠體金顆粒外表帶負電荷，可與目的蛋白質(zhì)所帶正電荷基團之間形成非共價鍵的靜電吸引而結(jié)實結(jié)合，這種結(jié)合對所標蛋白的生物學活性無明顯影響。吸附在膠體金外表的抗原或抗體能定向?qū)⒛z體金顆粒載運到組織或細胞內(nèi)、固相載體上的相應(yīng)抗體、抗原的位置。由于金顆粒具高電子密度的特性，這些標記物在抗原抗體反響處聚集到達一定密度時即金顆粒107個/2，出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色斑點7。膠體金標記物又被稱為膠體金結(jié)合物、膠體金探針或免疫金。被標記物須經(jīng)過徹底除鹽的預(yù)處理，而制備穩(wěn)定的膠體金結(jié)合物受多種因素影響，如金顆粒大孝離子濃度、被標記物用

6、量及標記體系的ph值等。最適ph值一般接近或略大于被標記物的等電點，而被標記物的用量取決于金顆粒的大校2.2免疫金標記技術(shù)的開展1971年,faulk等11把免疫膠體金標記技術(shù)用于細胞構(gòu)造的透射電鏡te研究后，關(guān)于膠體金制備和應(yīng)用研究的報道逐漸增多。1983年，hlgate等12將免疫金染色技術(shù)igs與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀染色法iungldsilverstaining,igss，利用膠體金催化溶液中銀離子的復(fù)原，使金屬銀在膠體金外表聚集，而聚集的銀又起到了催化的作用，使得更多的銀被復(fù)原如圖1。通過這種增強作用使得在光鏡下可視粒子的半徑比單獨的金顆粒增加了1050倍，這樣可以采用小顆粒

7、15n以增加標記密度，從而有效地進步了免疫膠體金標記的靈敏度?？乖璦ntigen;銀顆粒silvernanpartile;金顆粒gldnanpartile;抗體antibdy.近年來，免疫膠體金標記技術(shù)得到了不斷地開展和改良，微波技術(shù)開場應(yīng)用其中。galvez等13在不改變其它實驗條件的情況下采用微波技術(shù)進展標記，使標記過程中固定時間至少縮短20in。兩種技術(shù)的結(jié)合使標記效果更好，背景明晰，而且縮短染色時間。同時增加反響強度后較常規(guī)方法所需抗體濃度低，可節(jié)約價格昂貴的一抗。免疫層析法iunhratgraphy是20世紀90年代興起的一種快速診斷技術(shù)，膠體金免疫層析技術(shù)gia就是利用膠體金本身的

8、顯色特點結(jié)合免疫層析技術(shù)診斷特異性的待測物而開展起來的。這項技術(shù)既可采用雙抗體夾心法測抗原，又可用間接法、競爭法測抗體。在該技術(shù)根底上研制的膠體金免疫層析試紙條、試劑盒操作起來方便快捷，應(yīng)用前景廣闊。3免疫膠體金標記技術(shù)的應(yīng)用進展早期免疫膠體金標記技術(shù)主要應(yīng)用于光學顯微鏡觀察細胞外表抗原進展組化研究，但因靈敏度低而受到限制。igss創(chuàng)立以后免疫金標記技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。目前，免疫膠體金標記技術(shù)在組化中的應(yīng)用已日趨普遍，膠體金探針的種類也越來越多。由于膠體金的高電子密度使其在電鏡下明晰可辨，因此該技術(shù)進一步在電鏡上使用，由對組織細胞定位研究，進一步深化到了基因轉(zhuǎn)錄程度、基因表達的檢測、染色體的基

9、因定位、特定核酸序列在細胞內(nèi)的空間分布分析及核酸復(fù)制過程中的定性與定量分析等。3.1免疫膠體金標記技術(shù)在免疫檢測中的應(yīng)用免疫膠體金標記技術(shù)的逐步開展使其在免疫檢測等許多領(lǐng)域已得到越來越多的應(yīng)用。in等21分別制備核定位信號nls1及nls2抗體，電鏡檢測兩種金標抗體在a流感病毒vrnp構(gòu)造中的位點，以理解二者運輸vrnp中的不同作用。檢測結(jié)果顯示:71%的vrnps上檢測到nls1抗體，低于10%vrnps上檢測到nls2抗體。jiang等22結(jié)合微陣列技術(shù)與免疫金標記技術(shù)檢測弓形蟲感染、風疹、巨細胞病毒、泡疹trh對妊娠期婦女及胎兒危害極大的病毒ig抗體，檢出限達0.24g/l，操作方便。在

10、腫瘤診斷方面應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)結(jié)合生物體視學和圖像分析技術(shù)，討論良惡性腫瘤和癌前病變病理形態(tài)的定量診斷方法，使診斷的正確率明顯進步。由于膠體金具有肉眼可觀測的紅色，所以既可用于免疫電鏡、光鏡檢測，又能作為指示物結(jié)合固相載體用于體外免疫檢測抗原或抗體的存在。在檢測病原微生物方面，kalvathev23最早利用膠體金標記的抗立克次體的多克隆抗體、單克隆抗體及igy來檢測標本中的斑點熱群立克次體。zhu等24用膠體金標記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(prrsv)蛋白及蛋白n單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上與二抗構(gòu)造夾心構(gòu)造檢測prrsv，檢出限可達7.81031.6104tid50/l。3.2免疫膠體金

11、標記技術(shù)在環(huán)境檢測中的應(yīng)用由于免疫膠體金標記技術(shù)不斷地開展改良及其各種技術(shù)優(yōu)勢，已不僅僅局限應(yīng)用在單一領(lǐng)域。近年來在環(huán)境學科中的報道逐漸增多，主要表達在兩方面：一是利用免疫膠體金標記技術(shù)結(jié)合電鏡等檢測技術(shù)，通過觀察所測物質(zhì)的微觀構(gòu)造形態(tài)、空間位點變化來提醒其作用機理或者檢測宏觀性能指標；二是利用免疫層析技術(shù)制備免疫膠體金試紙條或試劑盒，現(xiàn)場快速檢測進展定性、定量分析。水體環(huán)境質(zhì)量對人類生活有直接影響，操作簡便、檢測快速、靈敏度高及選擇性好的水質(zhì)檢測方法能極大進步檢測效率。免疫膠體金標記技術(shù)便被逐漸應(yīng)用在水質(zhì)檢測及有關(guān)污染物分析研究中。吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，長期將未代謝完的非甾體抗炎藥排入

12、水體，將會對水生生物造成危害34。li等35制備的快速免疫層析金標試紙條，在10in內(nèi)檢測水樣中吲哚美辛的檢出限達0.1ng/l，且在室溫下可存放8星期，適應(yīng)于現(xiàn)場快速檢測。小球隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲會引起人類腸胃疾病，是水質(zhì)檢測的指標。rule等36結(jié)合外表增強共振拉曼散射serrs與免疫膠體金標記技術(shù)檢測這兩種病原體，證明了兩種技術(shù)的結(jié)合進展高靈敏度、多種物質(zhì)同時檢測的可行性。短裸甲藻毒素是一種與赤潮有關(guān)的神經(jīng)毒素。zhu等37利用膠體金標記的單克隆短裸甲藻毒素抗體制備了快速免疫層析試紙條，在10in的現(xiàn)場檢測時間內(nèi)檢出限為20g/l。檢測樣中短裸甲藻毒素濃度在104000g/l的范圍內(nèi)，試

13、紙條檢測區(qū)的顏色強度與短裸甲藻毒素濃度呈正相關(guān)。微囊藻毒素是由藍藻產(chǎn)生的一種七肽單環(huán)肝毒素，它通過食物鏈傳遞嚴重威脅人類安康。yung等38將選取的一株藍藻用一系列梯度乙醇脫水處理后，用低溫切片機切片進展金標記后，利用透射電鏡檢測微囊藻毒素在藍藻細胞中的位點以獲取微囊藻毒素如何產(chǎn)生、作用機理及衰亡等信息。結(jié)果顯示微囊藻毒素分布在類囊體、細胞原生質(zhì)、多磷體邊緣及羧化體中，在細胞壁及多磷體內(nèi)局部布較少。gerbersdrf39利用純化的高特異性微囊藻毒素抗體對微囊藻毒素進展免疫膠體金標記定位，檢測在不同光強度、光密度、光譜范圍下生長的藍藻細胞中微囊藻毒素的密度，發(fā)現(xiàn)光合有效輻射對微囊藻毒素的生物合

14、成影響很大。木質(zhì)素是農(nóng)作物秸桿及城市生活垃圾中一種常見的、難降解的物質(zhì)，處理不當會造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。因此，木質(zhì)素的研究逐漸引起人們的關(guān)注40。he等41利用紫外光顯微鏡、透射電鏡結(jié)合免疫膠體金標記，檢測了杜仲次生木質(zhì)局部化過程中木質(zhì)素等組分在細胞壁分布的動態(tài)變化，結(jié)果顯示隨著細胞次生壁的形成與木質(zhì)化，木質(zhì)素的分布逐漸擴展，其沉積出現(xiàn)不均勻的塊狀或片狀沉積形式。jseleau等42生物合成純化的紫丁香基脫氫多聚體以制備紫丁香基木質(zhì)素多克隆抗體，并利用免疫膠體金標記技術(shù)對植物細胞中紫丁香基木質(zhì)素進展定位檢測，發(fā)現(xiàn)其在s1層中分布較少，而在次生細胞壁形成后期分布較多。該小組還分別標記木質(zhì)

15、素抗體和紫丁香基木質(zhì)素抗體來檢測應(yīng)拉木中木質(zhì)素含量和構(gòu)造組成的關(guān)系，認為應(yīng)拉木凝膠層中木質(zhì)素含量較少，但紫丁香基木質(zhì)素構(gòu)造含量較高43。研究說明，白腐真菌是降解木質(zhì)素一類芳香化合物才能最強的微生物44。白腐真菌通過自身分泌的酶液的共同作用可迅速、有效地降解木質(zhì)素45。因此木質(zhì)素降解酶成為研究熱點，期望由此可理解微生物降解木質(zhì)素的機制。daniel等46將電鏡技術(shù)與免疫膠體金標記技術(shù)相結(jié)合，檢測白腐菌降解木質(zhì)素過程中分泌的關(guān)鍵酶液的空間分布及木質(zhì)素的形態(tài)變化情況，結(jié)果顯示酶分布與細胞壁構(gòu)造的形態(tài)改變有關(guān)，檢測發(fā)現(xiàn)胞外粘液為酶液進入細胞壁降解區(qū)域起了重要作用。4展望隨著城市化進程的加快，有機固體廢

16、物數(shù)量急劇上升。堆肥化是符合可持續(xù)開展的有機固體廢物處理方法，具有強大的生命力。免疫膠體金標記技術(shù)以其制備簡單、適用范圍廣、平安等優(yōu)勢趨于商業(yè)化應(yīng)用，在免疫學、醫(yī)學、食品科學等領(lǐng)域有著普遍應(yīng)用，但該技術(shù)應(yīng)用于堆肥環(huán)境研究的報道較少，特別是應(yīng)用于堆肥環(huán)境檢測的研究。堆肥化是微生物降解有機固體廢物的過程，加強堆肥過程中微生物對有機固體廢物的酶解作用便成為堆肥快速腐熟的關(guān)鍵。而堆肥過程中微生物所產(chǎn)生的生物酶蛋白的研究還不完善，結(jié)合經(jīng)濟可行性考慮，免疫膠體金標記技術(shù)在堆肥檢測中的應(yīng)用可以從以下幾個方面開展研究：1溫度、ph值等環(huán)境因素會影響酶促反響的效果，利用免疫膠體金標記技術(shù)對不同環(huán)境因素下酶蛋白進

17、展定位、定量檢測確定酶蛋白在堆肥基質(zhì)中的最正確作用條件；2微生物降解有機固體廢物過程中分泌的酶液并不是單一的，采取雙重或多重免疫膠體金標記檢測不同酶蛋白在堆肥過程中作用的區(qū)別與聯(lián)絡(luò)，從而提醒其微觀作用機理，確定協(xié)同作用效果最正確的酶液組合；3有機固體廢物降解是由酶液及多種小分子物質(zhì)共同協(xié)作完成。利用免疫膠體金標記技術(shù)在含有小分子物質(zhì)類別及數(shù)量不等的基質(zhì)環(huán)境下對酶蛋白進展檢測，確定小分子物質(zhì)與酶液在堆肥過程中的協(xié)同作用機理，有助于進步酶液降解有機固體廢物的效率；4有機固體廢物在降解過程中會發(fā)生物理形態(tài)等變化，實時檢測不同基質(zhì)條件變化下酶蛋白的作用位點及數(shù)量，對堆肥過程酶促降解作用的研究具有積極意

18、義。隨著技術(shù)的日趨成熟，進一步進步免疫膠體金標記技術(shù)的定位檢測特異性及定量檢測準確性，將使該技術(shù)在深化認識生物酶蛋白作用機制等堆肥檢測任務(wù)中發(fā)揮重要作用?！緟⒖嘉墨I】1zengg,huangdl,huanggh,hutj,jiangxy,fengl,henyn,tangl,liuhl.biresuretehnlgy,2022,98(2):320326huang,hiangk,linzh,leekh,hanght.anal.he.,2022,80(5):14971504slt,geuze.jellbil,1981,90(2):533536faulkp,talrg.iunhe,1971,8(11)

19、:10811083hlgates,jaksnp,enpn.jhistheythe,1983,31(7):3844galvezjj,gibersnrt,ardiffrd.j.histtehnl,2022,29(2):113121husy,henhk,hengh,huangy.anal.he.,2022,79(3):980985tanakar,yuhit,nagatanin,endt,kerank,takauray,taiyae.analbianalhe,2022,385(8):14141420abrsia,astanedat,killardaj,sythr,aleqrets,erkia.anal

20、.he.,2022,79(14):52325240naj,thaxtns,irkina.siene,2022,301(5641):18841886uh,eaverll,pantn.jurnalfleularbilgy,2022,374(4):910916jiangl,yuzb,dud,tangz,jiangt,zhangx,luzh.bisensrsandbieletrnis,2022,24(3):376382kalvathevz.atavirl.,1993,37(2):184186hih,ses,paekeh,paeksh.j.hratgr.b,2022,878(2):271277hus,l

21、iur,zhangs,huangz,xingz,zhangx.j.a.s.assspetr.,2022,20(6):10961103jahir,gundelh,irela.parasitles,2022,92(6):518519shi,zhas,zhangk,hngg,zhuz.jurnalfenvirnentalsienes,2022,20(11):13921397angs,zhang,angjp,zhangy.analhiata,2022,546(2):161166guyr,liusy,guij,zhugn.analbihe,2022,389(1):3239kaurj,singhkv,brr,thapikr,raje,varshneyg,surir.envirn.si.tehnl.