HCV核心蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達及自激活作用檢測

1、HCV焦點卵白在酵母雙雜交體系中的表達及自激活作用檢測劉敏，張偉,陳天艷,藺淑梅,劉錦鋒,葉峰，趙英仁，張樹林【關鍵詞】卵白RlefHVreprtEininyeastthybridsysteinreprtergeneexpressinandativatin【Keyrds】hepatitisvirusreprtein;yeastthybridsyste;reprtergene【摘要】目的：檢測用含丙型肝炎病毒(HV)焦點卵白的DNA片斷構(gòu)建的酵母雙雜交誘餌載體的表達產(chǎn)物對酵母細胞有無毒性作用及對陳訴基因有無激活作用.要領：PR擴增含HV焦點卵白差異巨細的DNA片斷，別離克隆入pU19質(zhì)粒，經(jīng)測序

2、準確后，再別離亞克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中.將重組質(zhì)粒導入酵母菌AH109，檢測其表達產(chǎn)物在酵母細胞中對陳訴基因有無激活作用.效果：樂成得到含HV焦點卵白的DNA片斷，HV焦點卵白對酵母菌AH109無毒性，且對陳訴基因無激活作用.結(jié)論：使用酵母雙雜交Gal4體系3研究與HV焦點卵白彼此作用的卵白,證明了HV焦點卵白無自激活成效.【關鍵詞】HV焦點卵白；酵母雙雜交；陳訴基因0弁言丙型肝炎病毒(hepatitisvirus,HV)焦點卵白位于病毒多肽的氨基末了，被宿主的信號肽酶切割后產(chǎn)生.HV焦點卵白除了作為核殼卵白具有病毒顆粒組裝成效外，還具有調(diào)治細胞凋亡、脂代謝、轉(zhuǎn)錄、免疫呈遞等作

3、用1,其氨基酸序列高度守舊，臨床和實行研究表現(xiàn)HV焦點卵白具有普及的反式激活作用2-3，與宿主卵白彼此作用，大概是病毒熏染導致肝細胞損傷和肝細胞癌產(chǎn)生、生長的緊張緣故原由.酵母雙雜交體系是一種闡發(fā)真核細胞中卵白卵白、卵白DNA、卵白RNA彼此作用的基因闡發(fā)要領.卵白質(zhì)與卵白質(zhì)的彼此作用是許多生命征象的底子4.酵母雙雜交Gal4體系3是在體系1和體系2底子上的革新，具有轉(zhuǎn)化服從高，假陽性率低等長處.我們使用它來克隆與HV焦點卵白彼此作用卵白的基因，以期為HV焦點卵白成效的研究提供新根據(jù).1質(zhì)料和要領1.1質(zhì)料克隆有HV全長DNA的質(zhì)粒pDNA3.0HV由第四軍醫(yī)大學微生物學教研室尹文博士惠贈；表

4、達載體pGBKT7，AH109酵母菌種美國lnteh公司；質(zhì)粒pU19菌種本研究室保存；PR試劑盒、DNA重組所用的種種限定性內(nèi)切酶、T4DNA毗連酶Gib公司；DNA電泳膠接納試劑盒上海華舜生物工程公司；酵母造就試劑美國lnteh公司.1.2要領2效果2.1焦點卵白基因片斷編碼區(qū)的擴增擴增出與預期巨細同等的DNA片斷圖1.焦點卵白巨細為588bp.2.2重組pU19焦點卵白質(zhì)粒的酶切斷定及序列闡發(fā)斷定準確的pU19焦點卵白重組質(zhì)粒別離作正反向測序，序列闡發(fā)表白所擴增的焦點卵白基因序列與登錄的HV焦點卵白基因序列完全同等圖2.2.3重組pGBKT7焦點卵白質(zhì)粒的酶切闡發(fā)見圖3.2.4ester

5、nBlt檢測卵白的表達在r為19103可見顯著目的條帶且無雜帶圖4.2.5HIS3陳訴基因表達的檢測可見單純AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生長，而含有pGBKT7焦點卵白質(zhì)粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生長，但全部克隆在SD/His和SD/Leu平板上均不生長.2.6LaZ陳訴基因表達的檢測含有HV焦點卵白的酵母細胞顯色中可見LaZ陳訴基因沒有被HV焦點卵白激活(圖5).當LaZ陳訴基因被激活時半乳糖苷酶大量表達，活性增高，在Xagal存在時，菌落顯深藍色，且擴散面積較大.3討論HV焦點卵白除了作為核殼卵白具有病毒顆粒組裝成效外，還具有多種調(diào)控細胞、病毒基因

6、表達及細胞生長以及免疫調(diào)治等成效.臨床和實行研究表現(xiàn)HV熏染與H產(chǎn)生生長歷程嚴密相干，此中病毒焦點卵白起到緊張的作用6.早期研究以為，HV屬于非整合性RNA病毒，與產(chǎn)生兩種確定作用的反式激活子X和截短的preS/S的HBV差異，并不存在直接致癌的病毒卵白.厥后研究證明焦點卵白也是一種反式激活卵白，其作用乃至凌駕X卵白7.焦點卵白對細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，尤其是NFB，AP1和SRE相干途徑具有顯著的加強作用8；在HeLa和HepG2細胞系中HV焦點卵白與TNFR1胞質(zhì)區(qū)彼此結(jié)合，影響TNFR1的信號通報，增長了TNF誘導的細胞凋亡，與細胞增殖、分化及慢性炎癥形成等有關9.在HepG2細胞中，焦點卵白

7、激活人類y基因、RSVLTR和SV40早期啟動子10；HV焦點卵白與p53協(xié)同粉碎宿主細胞的完備性，滋擾抗原遞呈和免疫反響,躲避種種非抗原特有用應因子掃除HV熏染肝細胞，使病毒得以復制11.如今的研究表白，病毒編碼的卵白對宿主細胞生長的調(diào)治作用大概是HV致癌的重要因素.HV焦點卵白是一種緊張的轉(zhuǎn)錄激活因子，可以或許反式激活同源/異源的病毒/細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)治序列，對HV的慢性化和促進肝細胞的轉(zhuǎn)化有嚴密的干系.我們擬使用焦點卵白作為誘餌，從人肝DNA文庫中去釣取與其彼此作用的卵白，以期對其成效有進一步相識.【參考文獻】1tsuka,KatN,TaniguhiH,etal.Hepatitisvirusr

8、eprtEininhibitsapptsisviaenhanedBlxLexpressinJ.Virlgy,2002,296(1):84-93.2BergqvistA,Rie.Transriptinalativatinftheinterleukin2prterbyhepatitisvirusreprteinJ.JVirl,2001,75(2):772-781.3LeeS,ParkU,LeeYI.HepatitisvirusreprteintransativatesinsulinlikegrthfatrIIgenetransriptinthrughatingnurrentlynEgr1andSp

9、1sitesJ.Virlgy,2001,283(2):167-177.4GietzRD,dsRA.SreeningfrprteinprteininteratinsintheyeastthybridsysteJ.ethdslBil,2002,185:471-486.5FrntRaine,RainJ,LegrainP.TardafuntinalanalysisftheyeastgenethrughexhaustivethybridsreensJ.NatGenet,1997,16(1):277-282.6riyaK,FujieH,ShintaniR,etal.Thereprteinfhepatiti

10、svirusindueshepatellulararinaintransgeniieJ.Nated,1998,4(9):1065-1067.7YuLR,hen,YehTS,etal.HepatitisvirusreprteininteratsithellularputativeRNAheliaseJ.JVirl,1999,73(4):2841-2853.8KatN,YshidaH,nNitaSK,etal.AtivatinfintraellularsignalingbyhepatitisBandviruses:virusreisthestptentsignalinduerJ.Hepatlgy,

11、2000,32(2):405-412.9atsut,HsiehTY,ZhuN,etal.HepatitisvirusreprteininteratsiththeytplasitailflyphtxinbetareeptrJ.JVirl,1997,71(2):1301-1309.10hangJ,YangSH,hYG,etal.HepatitisvirusrefrdifferentgentypeshasanngeniptentialbutisntsuffiientfrtransfringpriaryratebryfibrblastsinperatiniththeHrasngeneJ.JVirl,1998,72(4):3060-306