實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)書：“干實(shí)驗(yàn)”：微機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)

1、PAGE 1PAGE 294 實(shí)驗(yàn)十四 “干實(shí)驗(yàn)”：微機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn) 將計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)手段（即CAI）用于高等學(xué)校的教學(xué)工作，近年來已取得了很大發(fā)展，這是高校教學(xué)改革的重要方向。而將CAI用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，模擬動(dòng)態(tài)的實(shí)驗(yàn)過程，則難度較大，目前成熟的實(shí)用軟件還不多見。在生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)中使用計(jì)算機(jī)模擬純化生物大分子的實(shí)驗(yàn)軟件，意義就更為重大，因?yàn)樯髮?shí)驗(yàn)的試劑十分昂貴，要用到各種離心機(jī)和分光光度計(jì)，以及自動(dòng)部份收集器、電泳儀等十幾種儀器設(shè)備，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器裝備條件要求很高。此外，由于生物材料的組成十分復(fù)雜，生物大分子的含量通常極微量，實(shí)驗(yàn)流程又長(zhǎng)，有的實(shí)驗(yàn)要連續(xù)做一、二周，因而實(shí)驗(yàn)難度較大，如

2、果能在生化大實(shí)驗(yàn)中使用CAI，則可以獲得比其他實(shí)驗(yàn)課更顯著的教學(xué)效果。清華大學(xué)生物系生化大實(shí)驗(yàn)教學(xué)組多年前就十分重視CAI的工作，從1989年開始我們就將計(jì)算機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化的實(shí)驗(yàn)教學(xué)軟件用于生化大實(shí)驗(yàn)的教學(xué)，簡(jiǎn)稱為“干實(shí)驗(yàn)”。由于該軟件還有許多不足之處，1996年我們組織由朱濤同學(xué)負(fù)責(zé)的研究生科技小組重新編制了Windows界面下的實(shí)驗(yàn)教學(xué)軟件，學(xué)生們?cè)囉煤?，效果良好?下面分別介紹這兩套軟件。 用于DOS系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)模擬蛋白質(zhì)純化教學(xué)軟件： 這套軟件是國外贈(zèng)送的，由于在普通微機(jī)上無法使用，我系計(jì)算機(jī)室的教師對(duì)其進(jìn)行了改造，用于本科生和研究生的生化大實(shí)驗(yàn)。該軟件準(zhǔn)備了20種假想的酶，每種酶的

3、起始量都是527mg。軟件中提供了六種常用的生化分離純化方法，即： 熱處理(Heat treatment) 硫酸銨沉淀(Ammoniun sulphate precipitation) 離子交換層析(Ion exchange Chromatography) 凝膠過濾(Gel filtration) 制備等電聚焦(Preparation isoelectric focusing) 聚焦層析(Chromatofocusing) 分離純化時(shí)要求獲得盡可能高的產(chǎn)率Engyme yield (%)、純化倍數(shù)Enrichmant和盡可能少的“人時(shí)”消耗Cost (man-hours/100Units)。每

4、種分離純化方法都可以反復(fù)進(jìn)行。每一步操作后都可以用一維和二維電泳檢驗(yàn)產(chǎn)物的純度，并列表顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求所提純的酶達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)和純化倍數(shù)達(dá)到最大值。 Windows界面下計(jì)算機(jī)模擬純化蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)軟件： 由于DOS系統(tǒng)下的實(shí)驗(yàn)軟件已使用多年，而且是八十年代編制的，現(xiàn)已十分落后，分離純化實(shí)驗(yàn)條件的選擇太少，產(chǎn)率的計(jì)算時(shí)常超過100%，同一種酶使用不同的分離純化實(shí)驗(yàn)條件，有時(shí)會(huì)得到相同的結(jié)果，因此由1996年開始編制新的Windows界面下的實(shí)驗(yàn)軟件，軟件名稱是“Protein”，該軟件是用Visual Basic編寫的Win 3.1/Win 95應(yīng)用程序，界面簡(jiǎn)潔明

5、了，可以用鼠標(biāo)很方便的操作，并有完整的幫助文件，對(duì)操作方法和使用的各種生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳加說明，使用者短時(shí)間即可熟練操作。 “Protein”軟件有36個(gè)任務(wù)，即36組待分離純化的蛋白。任務(wù)要求利用軟件提供的幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提純每一個(gè)目的蛋白，最終達(dá)到單向電泳一條帶，雙向電泳一個(gè)點(diǎn)，而且使用的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)(根據(jù)提取步驟計(jì)算得到)不得超過一個(gè)特定值。在每個(gè)任務(wù)開始時(shí)，軟件給出目的蛋白的一些性質(zhì)，如熱穩(wěn)定的溫度范圍和pH穩(wěn)定范圍等，利用這些信息，可以使實(shí)驗(yàn)少走彎路。 “Protein”提供的分離純化方法有七種：熱變性；硫銨沉淀；排阻層析(凝膠色譜)；離子交換層析；吸附層析；聚焦層析；制備電泳。 例如，在使

6、用層析方法時(shí)，可在Chromatography菜單下點(diǎn)選上述四種層析方法，彈出相應(yīng)的參數(shù)對(duì)話框，此時(shí)要求輸入柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、柱填料類型、緩沖液組分及pH值和洗脫速度等。如果采用梯度洗脫，還要求輸入梯度洗脫的初始和終末濃度及洗脫體積，在輸入?yún)?shù)之后，計(jì)算機(jī)模擬洗脫過程，并且畫出A280洗脫曲線和酶活曲線，此時(shí)，可以根據(jù)分離的情況和酶活的峰位來收集組份，在收集之前還可以用電泳查看洗脫曲線上某一部位的分離效果。在確認(rèn)收集之后，“Protein”軟件記錄該步操作的條件，計(jì)算回收率、純化倍數(shù)以及消耗的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)等。 經(jīng)過反復(fù)多次的模擬實(shí)驗(yàn)，初步純化了目的蛋白，在雙向電泳圖上能夠確定該蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)之

7、后，還需要重新對(duì)其各步驟的實(shí)驗(yàn)條件，尤其是離子交換層析、排阻層析和制備電泳等實(shí)驗(yàn)步驟的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行修改，以找到適合該蛋白質(zhì)的最佳分離純化實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)條件。 在“Protein”所提供的各種分離純化方法中，熱變性法和鹽析法是比較好的粗提方法，在提純的早期使用效果較好。層析是各種方法中最強(qiáng)有力的方法，制備電泳雖然純化倍數(shù)高，但是回收率低。在各種層析方法中，又以離子交換層析最為有效和易于使用，并且耗費(fèi)的人時(shí)和經(jīng)費(fèi)也較少。排層層析和聚焦層析耗費(fèi)較大，但在某些特定情況下，這兩種方法是不可替代的。 “Protein”提供了四種電泳方法：即，SDS、PAGE、等電聚焦電泳和雙向電泳。這些電泳方法不但可以用以檢測(cè)樣品的純度，而且也給出了樣品的一些信息，如分子量、等電點(diǎn)等，這些信息對(duì)于后續(xù)提純有重要的參考價(jià)值，等電聚焦電泳和PAGE還可以用于制備。 通過多年的CAI教學(xué)實(shí)踐，尤其是“Protein”新軟件的投入使用，使我系生化大實(shí)驗(yàn)的CAI教學(xué)水平上了一個(gè)新臺(tái)階，它的優(yōu)點(diǎn)是：在幾小時(shí)內(nèi)可以模擬完成大量的生化實(shí)驗(yàn)分離純化過程，既經(jīng)濟(jì)，效率又很高，實(shí)現(xiàn)了學(xué)生們想設(shè)計(jì)生化大實(shí)驗(yàn)的要求，而在實(shí)驗(yàn)室里要想實(shí)現(xiàn)這一過程是非常困難的。通過“干實(shí)驗(yàn)”的教學(xué)，對(duì)生化大實(shí)驗(yàn)中的各種實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)的比較和選用，對(duì)所用的幾種主要生化