論ＤＨＰＬＣ技術(shù)在基因突變檢測上的應(yīng)用

1、論技術(shù)在基因突變檢測上的應(yīng)用摘要：dhpl用來檢測dna突變和單核酸多態(tài)性，可以取代傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，不需要制備凝膠，檢測dna片段做到了全自動、高效、快速、準(zhǔn)確，在疾病相關(guān)基因突變檢測方面提供了有效的技術(shù)手段，是一種快速有效的基因突變篩查方法。關(guān)鍵詞：dhpl技術(shù)；基因突變；檢測1dttpl技術(shù)原理變性高效液相色譜(dhpl)是一種高通量、自動化的基因突變檢測技術(shù)。該技術(shù)已在醫(yī)學(xué)、癌癥、藥物等研究領(lǐng)域開展應(yīng)用，與ssp和dna直接測序等突變檢測技術(shù)相比，dhpl具有靈敏性更高，特異性更強，廉價省時等優(yōu)點。dhpl技術(shù)的原理是基于未解鏈的和局部解鏈的雙鏈dna在局部失活條件下具有不同保存的性

2、質(zhì)。這種局部失活條件可以采取升高溫度的手段獲得。所有基因組dna的單拷貝均可通過pr反響大量擴增，雜合子個體的dna經(jīng)擴增產(chǎn)生異源雙鏈，由于錯配位點的氫鍵被破壞，因此在異源雙鏈上形成“鼓泡，導(dǎo)致它與純合子個體的dna擴增產(chǎn)物完全匹配的同源雙鏈的解鏈特征不同。在局部加熱變性的條件下，異源雙鏈dna分子更易于解鏈形成y形構(gòu)造，與固定相的結(jié)合才能降低。當(dāng)流動相中乙腈濃度梯度增大時，異源雙鏈將先于同源雙鏈被洗脫出來，帶有突變序列的樣品呈現(xiàn)出異源雙鏈和同源雙鏈混合物的峰形特點，而不含突變序列的樣品那么只有同源雙鏈的峰形。據(jù)此可檢測出含有單個堿基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段，從而提供有無突變的信息。2

3、dhpl技術(shù)在突變基因診斷中的應(yīng)用基因突變是指基因組dna分子在構(gòu)造功能上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變，主要包括堿基的交換和小片段的缺失或插入，它是導(dǎo)致基因型疾病的重要原因之一。基因突變在生物醫(yī)學(xué)研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。隨著人類基因組整體測序方案的開展，探究基因突變的任務(wù)變得非常迫切。隨著人類基因組整體測序方案的開展，探究基因突變的任務(wù)變得非常迫切。dhpl技術(shù)自最早被用于分析人y染色體單核苷酸多態(tài)性位點(snp)以進展人種進化的遺傳性研究；此后還用于篩查致病基因突變位點、分析單核背酸多態(tài)性以及基因啟動子pg島甲基化修飾改變等研究；因其靈敏性及準(zhǔn)確度均較

4、高，操作實現(xiàn)了半自動化，檢測周期短、費用低，尤其合適于基因構(gòu)造復(fù)雜而無突變熱點或突變頻率低于20的單基因變異，以及多基因致病突變。(1)散發(fā)性卵巢癌p53基因突變定位于17染色體的p53基因是目前研究得最廣泛的抑癌基因，迄今發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤的2500種基因突變中，p53蛋白的393個氨基酸就有280個位點存在突變，其直接的后果是導(dǎo)致氨基酸的改變，最終使p53蛋白失活，喪失抑癌作用。杜明和豐有吉，利用dhpl來檢測50例散發(fā)性卵巢癌p53基因外顯子5，8的突變，18例突變都可以使用dhpl的方法發(fā)現(xiàn)，沒有假陽性和假陰性。說明dhpl可以用于臨床篩查基因突變，并且對于異質(zhì)性腫瘤而言，dhpl檢測基因

5、突變無疑是最可靠的。(2)胃癌組織基因突變魯猻、徐惠綿、任群等人利用dhpl對39例胃癌組織及血清中p53基因突變進展檢測，并測序驗證。在他們的研究中p53基因的突變率為21(8/39)；其中腸型胃癌突變率40(6/15)明顯高于彌漫型胃癌8.33(2/24)(p0.01)；發(fā)現(xiàn)既往未見報道突變3例。這充分說明了dhpl是一項較好的檢測胃癌組織中基因突變的篩查方法(3)漢族人i型多囊腎致病基因突變張樹忠等人，通過采用dhpl技術(shù)檢測漢族人常染色體顯性多囊腎病(adpkd)i型致病基因pkdl的突變：以來源于19個adpkd家系的67名成員血樣標(biāo)本的基因組dna為模板，通過長鏈pr和巢式pr結(jié)合

6、擴增的方法擴增pkdl全編碼區(qū)，然后采用dhpl方法進展初步篩查，將存在異常色譜圖的擴增產(chǎn)物經(jīng)核苷酸測序，確定突變的詳細(xì)位點和類型，共檢測出14個致病突變，包括10個錯義突變、1個插入突變、1個缺失突變、2個無義突變。他們實驗結(jié)果充分說明了dhpl方法可以作為更為有效篩查漢族人adpkdpkdl突變位點的檢測途徑。(4)乳腺癌bral基因突變bral基因為“乳腺癌1號基因，位于17q21，有22個編碼外顯子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約4050的遺傳性乳腺癌和卵巢癌患者bral基因發(fā)生突變。李丹等利用聚合酶鏈反響pr擴增bral基因，該擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，直接進展dhpl分析，從124例乳腺癌患

7、者中共發(fā)現(xiàn)9種突變，確定了9種乳腺癌患者可能發(fā)生的突變類型，為今后臨床應(yīng)用dhpl對高危人群brai基因進展早期基因檢測提供了9個位點，所有dphl檢測顯示峰型異常的樣品經(jīng)測序證明均存在突變或者shp，證明該技術(shù)陽性檢測率為100。且具有操作簡單、快速、敏感、準(zhǔn)確且經(jīng)濟等特點。3dhpl技術(shù)與其他技術(shù)在突變基因診斷中的結(jié)合應(yīng)用目前在核酸分析領(lǐng)域與hpl聯(lián)用的檢測手段有紫外(ultraviletphtetridetetr，uv)、熒光(fluresenedetetr)、質(zhì)譜(assspetretry，s)等。其中紫外檢測器(uv)憑借其良好的通用性成為應(yīng)用最為廣泛的檢測器，但靈敏度不高的弱點使其

8、使用受到一定的限制。在核酸分析和一些突變掃描方法中有時需要更高的靈敏度，這時具有更高靈敏度和選擇性的熒光檢測器成為首眩但是熒光檢測器要求使用熒光標(biāo)記物，且通常使用的染料如吖啶黃、溴化乙錠是有毒物質(zhì)。salan實驗室開發(fā)出sybrgreen，染料不僅具有更好的靈敏度，而且使用更平安。激光誘導(dǎo)熒光是目前靈敏度最高的檢測方法之一。heker等采用熒光標(biāo)記pr引物、激光誘導(dǎo)熒光方式進展檢測，證明dhpl方法可以區(qū)別含量相差500倍的兩個等位基因，這使多份樣本的混合檢測成為可能。同時熒光標(biāo)記單鏈，使色譜圖的解釋變得更加容易。美國transgenie公司在aver核苷酸片段分析系統(tǒng)技術(shù)平臺根底上，開發(fā)出一

9、種后熒光檢測技術(shù)。在所有分析條件不變的情況下，被檢測的核酸片段經(jīng)dhpl別離之后在混合室中與熒光試劑混合，然后進展檢測，不僅可以進步靈敏度上百倍，而且不需要昂貴的熒光標(biāo)記引物。近年來電噴霧離子化一質(zhì)譜(eiss)作為一種重要的構(gòu)造分析工具與irrphpl聯(lián)用也已應(yīng)用于核酸分析領(lǐng)域，該聯(lián)用技術(shù)不僅可以確證被別離的單鏈dna的成分特性，還可以確證擴增的pr產(chǎn)物的基因型。眾所周知，在核酸的質(zhì)譜分析中為了獲得高置信度的分析結(jié)果，對分析物進展適當(dāng)?shù)拿擕}和去除小分子量雜質(zhì)是必不可少的，這也正是hpls的魅力所在，但質(zhì)譜的高本錢使該項技術(shù)較難推廣使用，4總結(jié)dhpl用來檢測dna突變和單核酸多態(tài)性，可以取代傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，不需要制備凝膠，檢測dna片段做到了全自動、高效、快速、準(zhǔn)確，在疾病相關(guān)基因突變檢測方面提供了有效的技術(shù)手段，是一種快速有效的基因突變篩查方法。dhpl技術(shù)也有缺乏之處：對pr要求很高；不能直接檢測出純合突變，只能提供個體樣本有無突