耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因多態(tài)性分型研究

1、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因多態(tài)性分型研究【摘要】目的探究一種準(zhǔn)確、快速、可靠的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(rsa)的分子生物學(xué)分型方法，理解醫(yī)院內(nèi)rsa的多態(tài)性，為臨床合理、有效地使用抗生素和控制耐藥基因在種群間的傳播提供幫助。方法用ea基因相關(guān)高變區(qū)pr擴(kuò)增(hvr-pr)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna(rapd)兩種方法，對(duì)rsa菌株進(jìn)展多態(tài)性分析。hvr-pr檢測(cè)ea基因相關(guān)高變區(qū)正相重復(fù)序列元件(drus)的長(zhǎng)度，根據(jù)drus數(shù)目的不同對(duì)rsa分型;rapd根據(jù)電泳圖譜中條帶的數(shù)目及位置，經(jīng)ntsys統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展聚類(lèi)分析，得到遺傳樹(shù)狀圖，按rsa菌株之間的相關(guān)性進(jìn)展分型。結(jié)果應(yīng)用hvr-pr

2、方法可將31株rsa標(biāo)本分為7型，分別含有7、8、9、10、11、12和16個(gè)drus，其中10drus型最多11/31(35.48%)，16drus型最少1/31(3.23%);應(yīng)用rapd分型，31株rsa共分10型，其中以型為主10/31(32.26%)，其他型分布比擬接近。在11株hvr-pr分型的10drus型中rapd型4株4/11(36.36%)，rapd型和rapd型各2株2/11(18.18%);10株rapd型中9drus型、10drus型各4株4/10(40.00%)。結(jié)論rapd方法和hvr-pr方法對(duì)rsa的分型率都比擬高，而且這兩種方法都比擬簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠、快速，

3、實(shí)用性強(qiáng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。【關(guān)鍵詞】耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;ea基因;隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna;ea基因相關(guān)高變區(qū)pr擴(kuò)增keyrds:ethiillin-resistantstaphylusaureus;eagene;randaplifiedplyrphidna;prfrthee-assiatedhypervariableregin葡萄球菌的分型方法很多，傳統(tǒng)的分型方法包括血清學(xué)分型、抗生素分型等，但均無(wú)法滿(mǎn)足準(zhǔn)確區(qū)分的要求。分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為這一領(lǐng)域帶來(lái)了革命。目前，分子分型方法已成為研究細(xì)菌耐藥性發(fā)生及傳播的重要手段，常見(jiàn)的有：脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-fielgeleletr

4、phresis,pfge)，隨機(jī)擴(kuò)增dna多態(tài)性(randaplifiedplyrphidna,rapd)，ea基因高變區(qū)長(zhǎng)度多態(tài)性(prfrthee-assiatedhypervariableregin,hvr-pr)，熒光擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(fluresentaplifiedfragentlengthplyrphris,faflp)等。這些方法各有特點(diǎn)，應(yīng)用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(ethiillin-resistantstaphylusaureu,rsa)的分型在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，但這些方法尚未成熟，各地分型標(biāo)準(zhǔn)也不一樣，且多采用單一的分型方法。rapd和hvr-pr結(jié)合應(yīng)用于rsa多態(tài)

5、性分型尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用rapd和hvr-pr兩種方法對(duì)rsa菌株進(jìn)展分型，理解其多態(tài)性分布狀況、鑒別菌株之間的相關(guān)性，為合理、有效地使用抗生素和控制耐藥基因在種群間的傳播提供理論基矗1材料與方法1.1材料;溶菌酶(活力單位2000u/g)、蛋白酶k購(gòu)自aress生物公司;金黃色葡萄球菌ea基因pr檢測(cè)引物和hvr-pr、rapd多態(tài)性分析引物，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。dna擴(kuò)增儀為jresearhin公司的pt-200pr儀;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為美國(guó)bi-rad公司產(chǎn)品;zf紫外分析儀購(gòu)自上海小源科技。1.2方法參加pr反響體系：hvrp1和p2引物各1l(引物濃度10l/l)，

6、2praster12.5l(3l/lgl2、0.5l/ldntp、0.1u/ltaqdna聚合酶、20l/ltris-hl、100l/lkl，含染料)，滅菌去離子水ddh29.5l，反響總體積為25l。pr反響條件：94預(yù)變性5in;9460s，5645s，72，60s，35個(gè)循環(huán);72延伸5in。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后分析結(jié)果。參加pr反響體系：rapd引物ep0071l(引物濃度10l/l)，rapd引物kay11l(引物濃度10l/l)，2praster12.5l(3l/lgl2、0.5l/ldntp、0.1u/ltaqdna聚合酶、20l/ltris-hl、100l/lk

7、l，含染料)，滅菌去離子水ddh29.5l，反響總體積為25l。pr反響條件：94預(yù)變性2in;9445s，3445s，72，60s，35個(gè)循環(huán);72延伸5in。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15g/l瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)展成像分析。2結(jié)果2.1rsa的hvr-pr分型結(jié)果應(yīng)用hvr-pr方法對(duì)31株rsa標(biāo)本進(jìn)展分型，一共可以分為7型，分別含有7、8、9、10、11、12和16個(gè)drus。所有的rsa都可以擴(kuò)增出長(zhǎng)度450820bp的基因片段，用hvr-pr分型方法都可以加以區(qū)分，分型率到達(dá)了100%。drus的數(shù)目=(擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度-171)/40，其中171是存在于擴(kuò)增序列之中而沒(méi)有重復(fù)

8、的序列片段長(zhǎng)度，40是每一個(gè)正向重復(fù)單元序列的長(zhǎng)度。所有rsa菌株中，10drus型最多(11/31，35.48%)，其次是9drus型(8/31，25.81%)，11drus型(4/31，12.90%)，7drus型(3/31，9.68%)，12drus型(2/31，6.45%)，8drus型(2/31，6.45%)，最少的是16drus型(1/31，3.23%)。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。2.2rsa的rapd分型結(jié)果比擬接近。根據(jù)遺傳樹(shù)狀圖分布情況可知各菌株間遺傳性狀，其中rapd型、型差異較小，均有4條帶;rapd型、型、型遺傳性狀也比擬接近，各有4條帶，但是條帶在位置上有所差異;rapd型、

9、型差異較小，型有2條帶，型只有1條帶。遺傳間隔 樹(shù)狀圖和rapd分型結(jié)果見(jiàn)圖3。圖2rapd的電泳圖fig.2theeletrphresisresultfrapd：dnaarker;1、2、3、5、9：rapd型;4、6：rapd型;7、8：rapd型。應(yīng)用rapd與hvr-pr對(duì)31株rsa進(jìn)展結(jié)合分型，這兩種方法的分型率都比擬高，都到達(dá)了100%。在11株hvr-pr分型的10drus型中rapd型4株(36.36%)，rapd型和rapd型各2株(18.18%);10株rapd型中9drus型、10drus型各4株(40.00%)(表2)。表2rapd與hvr-pr對(duì)rsa的結(jié)合分型圖3

10、31株rsa的遺傳間隔 樹(shù)狀圖fig.3thegenetidistanetreef31rsas橫坐標(biāo)為相關(guān)系數(shù)，縱坐標(biāo)為菌株編號(hào)。3討論根據(jù)hvr多態(tài)性，將31株rsa分為7型，以10drus型多見(jiàn)，共11株(35.5%)，16drus型少見(jiàn)，只有1株(3.23%)。senna等1報(bào)道，根據(jù)hvr多態(tài)性將從巴西prtalegre地區(qū)別離的254株rsa分為8型。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)3drus型及5drus型，而多了16drus型，這可能與菌株數(shù)較少有關(guān)，也可能本地區(qū)無(wú)此型菌株存在，有待進(jìn)一步研究。采用hvr-pr法對(duì)rsa進(jìn)展分型，與rsa的表型分型法、藥敏試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)于追蹤rsa感染源、控制流行、

11、指導(dǎo)臨床抗菌藥物的合理應(yīng)用具有重要意義。另外，rsa中dru不同重復(fù)次數(shù)有何詳細(xì)生物學(xué)意義，即片段大小不同對(duì)pbp2a構(gòu)型及其介導(dǎo)耐藥性上下的關(guān)系有何影響，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，有待進(jìn)一步討論。shitz等3用pfge、rapd、16-23srdna、蛋白apr、hvr-pr、凝固酶基因pr對(duì)183株rsa分型，發(fā)現(xiàn)pfge結(jié)果與hvr-pr結(jié)果相近，對(duì)rsa都有比擬高的區(qū)分才能。ihelhaus等4同時(shí)應(yīng)用凝固酶基因多態(tài)性、spa基因多態(tài)性，ea基因高變區(qū)長(zhǎng)度多態(tài)性及pfge對(duì)46株rsa進(jìn)展分子分型研究，證實(shí)了這3種特異功能集團(tuán)的多態(tài)性分型方法與pfge分型一致，合適于短時(shí)間如幾天到幾周內(nèi)的流行

12、病學(xué)分析，12h可出結(jié)果，而pfge那么需5d或更長(zhǎng)時(shí)間。雖然hvr-pr沒(méi)有pfge對(duì)rsa分型效果好，但是比凝固酶基因pr更能有效地對(duì)rsa分型，而且分型率比擬高，對(duì)其流行病學(xué)研究有重要的意義5。ea基因是耐甲氧西林葡萄球菌所特有，而hvr基因高變區(qū)與該基因嚴(yán)密相連，存在于其下游，也具有特異性。hvr-pr法操作簡(jiǎn)單、快速，不需要特殊的電泳設(shè)備和限制酶消化，大多數(shù)的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室皆可進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)在藥敏試驗(yàn)的根底上采用雙引物rapd法對(duì)31株rsa進(jìn)展了基因分型，根據(jù)rapd電泳圖譜中條帶的數(shù)目及位置，經(jīng)ntsys統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展聚類(lèi)分析，得到遺傳樹(shù)狀圖。31株rsa共分為10個(gè)基因型。韓立中

13、等6用rapd法將檢測(cè)菌株分為4個(gè)型別(ad型)，分型區(qū)別較大的原因可能是rapd引物選擇的不同，另外由于使用隨機(jī)的引物，一旦基因組dna分子發(fā)生片段插入、缺失或堿基突變，將造成引物特定結(jié)合位點(diǎn)的變化，使pr擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶發(fā)生分子量和數(shù)目的改變。ille等7在美國(guó)紐約市立醫(yī)院及紐約疾病控制中心共搜集103株金黃色葡萄球菌，用rapd分型方法共檢測(cè)出71株rsa，檢出率高達(dá)69%，其中52株被認(rèn)為與醫(yī)院和社區(qū)感染有關(guān)，其他19株同源性相差較遠(yuǎn)，被認(rèn)為是流行病學(xué)無(wú)關(guān)株。vanbelku等8曾用3種rapd引物(rapd1、rapd7和eri2)對(duì)金黃色葡萄球菌分型，并同pfge作比擬，證實(shí)rapd

14、是金葡菌基因分析以及監(jiān)測(cè)醫(yī)院感染流行較理想的分型手段。rapd的特異性好、分析周期短、簡(jiǎn)易、穩(wěn)定、可靠、不需要特殊試劑和生物材料，適用于所有生物的分型，尤其是對(duì)一些尚未建立標(biāo)準(zhǔn)分型方法和缺乏血清型等方法的菌屬(種)的鑒定和分型特別實(shí)用。美國(guó)醫(yī)院流行病學(xué)協(xié)會(huì)已推薦該方法為醫(yī)院感染中常見(jiàn)病原菌的分型方法9。因此，rapd技術(shù)在傳染病學(xué)、微生物流行病學(xué)和醫(yī)院內(nèi)感染學(xué)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。在rsa的流行病學(xué)研究中，往往會(huì)把幾種方法結(jié)合使用，這樣對(duì)rsa的流行病學(xué)分析往往會(huì)更加準(zhǔn)確。李家泰等10采用hvr-pr基因型和腸毒素基因型相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)兩種基因型結(jié)合起來(lái)有助于進(jìn)步rsa分型的可靠性。本實(shí)驗(yàn)將rap

15、d方法與hvr-pr方法相結(jié)合，以藥物敏感實(shí)驗(yàn)為根底，對(duì)臨床別離的rsa做流行病學(xué)分析。rapd方法和hvr-pr方法對(duì)rsa的分型率都比擬高，都到達(dá)了100%，而且這兩種方法都比擬簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠、快速，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)rsa進(jìn)展分型。研究中還發(fā)現(xiàn)這兩種方法之間沒(méi)有很好的相關(guān)性，即一樣的rapd型可以表現(xiàn)出不同的hvr-pr型;反之，一樣的hvr-pr型也可以呈現(xiàn)出不同的rapd型。【參考文獻(xiàn)】1sennajp,pinta,arvalhlps,etal.parisnfpulsed-fieldgeleletrphresisandpranalysisfplyrphissntheehypervar

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