U1 snRNP防止前體mRNA過早切割和多聚腺苷酸化

1、U1snRNP防止前體mRNA過早切割和多聚腺苷酸化在真核生物中，U1小核核糖核蛋白（snRNP）與U2,U4,U5和U6的snRNPs形成平等的化學計量學的剪接；然而，它在人類的豐富度遠遠超過其他snRNPs。在這里，我們用反義嗎啉代寡核苷酸到U1snRNA的實現在HeLa細胞中U1snRNP擊倒的功能，并確定基因平鋪芯片累計未拼接前體RNA。在除了抑制拼接,U1snRNP擊倒造成早產兒在眾多的前體RNA切割和聚腺苷酸在神秘的多聚腺苷酸信號，經常在附近（5個堿基）的談話開始的內含子。這沒有發(fā)生時，剪接抑制U2snRNA的反義嗎啉代寡核苷酸或U2-snRNP失活的藥物spliceostatin

2、除非U1的反義嗎啉寡核苷酸也被列入。我們進一步的研究表明，U1的snRNA的前體mRNA的堿基配對需要抑制位于內含子從附近神秘的多聚腺苷酸信號過早分裂和多聚腺苷酸。這些發(fā)現揭示了U1snRNP關鍵拼接獨立的功能，在保護的轉錄，我們提出解釋其過多。在真核細胞中的信使RNA,產生廣泛的轉錄后加工的初級轉錄（前體RNA），包括5端的封蓋，去除內含子的剪接，和3端切割和多聚腺苷酸丄-4。每個剪接反應進行了1剪接，一個大型的RNA-蛋白質復合物，主要由小核的RNPs（snRNPs）5-8。在U1,U2，U4U6和U5的snRNPs的主要（U2類型）剪接的組成部分，而一個更豐富（1）未成年人（U12型）剪

3、接，U12，U11的組成，U4atac,U6atac和U5snRNPs5,9-11。snRNPs,由特定的RNA結合蛋白的幫助下，認識到，由snRNA的前體mRNA的堿基配對，在前體RNA的典型序列定義在主要和次要類內含子，包括內含子/外顯子交界處的5-3-剪接位點。U1snRNP起著至關重要的作用定義5由RNA剪接位點：通過5RNA堿基配對的核苷酸序列的U1snRNA的九個。形成剪接的催化核心，snRNPs1:1化學計量學一起作為一個模塊化的機器5。然而，在細胞中的各種snRNPs的豐度并不反映在剪接equimolarity。U1snRNP,在10估計拷貝數，這是特別引人注目的人體細胞（He

4、La細胞），每&分子是在高等真核生物的其他snRNPs豐富得多12。不知道的snRNPs不同金額的潛在作用。我們在探索蜂窩snRNP豐富的潛在功能的興趣源于早先的意見，缺乏生存的運動神經元（SMN）的蛋白質，在snRNP合成的重要組成部分，在孫廿，擾亂正常的細胞豐度的snRNPs（snRNP劇目）18,*并引起了廣泛的剪接異常。拼接snRNP豐度變化，在一般的SMN缺乏分子后果可能造成的影響是重要的，因為的SMN缺乏是脊肌萎縮癥（SMA）的，往往是致命的運動神經元退行性疾病的原因，20-22。然而，snRNP劇目的變化發(fā)生在一個缺乏癥SMN-SMA小鼠模型，在不同的組織而異，統一為所有的snR

5、NPs18日，19日，包括雙雙下跌，同時幾個snRNPs水平上調，使他們很難概括。為了規(guī)避這個問題，我們調查個別snRNPs功能減少使用反義嗎啉代寡核苷酸（古跡辦）的轉錄的影響。我們的實驗顯示為U1snRNP保護過早切割和多聚腺苷酸（防落素），有別于其在剪接作用的前體RNA意想不到的功能。AMO與U1snRNP功能擊倒U1snRNP功能，以減少數量，我們設計了一個AMO，占地面積5的U1snRNA的（U1的AMO），以阻止其結合到5剪接位點。以確認U1的AMO結合到U1snRNP和確定抑制它在細胞所需的金額，我們進行了核糖核酸酶H保護法。從細胞中提取轉同一個加擾控制AMO23，24或核糖核酸酶

6、HU1的AMO的不同濃度培養(yǎng)和反義DNA寡核苷酸探針也補充U1的snRNA的5端序列（圖匕）。觀察一個劑量依賴性下降裂U1的snRNA的金額轉U1的AMO的數量增加（圖1a），U1的AMO，阻止反義DNA寡核苷酸探針結合，并征求核糖核酸酶H消化。U1snRNA的5在細胞中的堿基配對完成或接近完成干擾觀察與U1的AMO（7.5微米圖更）。此外，我們使用U1的snRNA的5序列（新臺幣1-25），以確定如果U1的AMO被捆綁在細胞相同的序列互補與LNA探針原位雜交。圖像（圖1b）顯示，U1的AMO確實在呈劑量依賴性和盾牌U1的snRNA的5序列，這個序列是完全無法7.5MU1的AMO,U1的AMO

7、的所有后續(xù)轉染實驗中使用的濃度。為了確認，U1的AMO抑制U1snRNP的活動，直接，我們在體外拼接測試其效果。在圖1c，U1的AMO,但不是控制AMO,大力減少拼接產品為Ad2AIVS量。因此，U1的AMO的功能滅活U1無論是在體內和體外snRNP。U1的AMO結合到5的U1snRNA的序列，并抑制其剪接活動未拼接的前體RNA的積累后，剪接抑制為了獲得U1snRNP擊倒，包括內含子和外顯子上的影響后發(fā)生的轉錄變化的全球高分辨率的圖片，我們分析了準備從要么U1或控制AMOS使用Affymetrix基因芯片人力平鋪2.0RE陣列的轉染HeLa細胞的總RNA。這種高密度的基因平鋪陣列包括瓷磚探針（

8、25-MER寡核苷酸間隔10NT），5，7和16條染色體，估計包含3600基因覆蓋整個基因組序列。所有的實驗進行了單獨的生物一式三份，并處理為8小時，使轉染細胞恢復和足夠的信號積累上述背景。作為參考，我們在并行處理的細胞的強有力的和一般的剪接抑制劑，spliceostatin（SSA），目標剪接因子SF3b的，組件的U2樂隊snRNP25。由于每個前體RNA體量通常是非常小，不易察覺，內含信號的大量增加提供未拼接的前體RNA積累的最確切的證據，以確保相應的序列進行了積極轉錄和其未拼接的成績單是不夠穩(wěn)定要拿下。進行統計分析，以確定超過以下閾值的顯著變化：倍變化$2,p值0.01和受災地區(qū)的長度$

9、100新臺幣（相當于3個或更多的連續(xù)探頭）。這確定的319個基因顯示，通常由一個或多個內含子中無論U1的AMO（211個基因）或公共福利金（216基因）的積累。從一開始，我們預期由于剪接抑制兩種模式。一個普遍下降，從談話的所有信號可以反映未拼接的前體RNA體是較穩(wěn)定，并迅速退化，但是，我們并沒有包括在我們的分析，因為他們也可能會導致轉錄的下調。我們還預計，U1的AMO和SSA將顯示整個談話作為一般的剪接抑制內含積累類似的模式，但只有98個基因（30.7%）ETF1（例證，這是觀察圖2）。少數的基因（41個基因;12.9），其他配置文件，但沒有表現出任何連貫的模式然而，出乎意料的是，大多數基因（

10、180個基因；56.4%）表現出不同的圖案U1的AMO和SSA（HSPA9，SRRM2和CBFB圖2）基因組平鋪陣列識別未拼接的前體RNA繼U1的AMO和spliceostatin（SSA）的治療U1snRNP擊倒導致防落素最顯著，廣大U1的AMO轉染細胞在受影響的基因表明了類似的模式，內含強烈的信號，提前終止向公共福利金，例如，在HSPA9，SRRM2和CBFB組成，如圖2中箭頭表示。這通常發(fā)生在內含子，在第一季度的基因5具有強大的偏見，為幾個功能在不同的基因圖3所示。值得注意的是，在U1AMO轉染細胞在未拼接內含信號的急劇下降，經常在3-5KB從談話開始。從U1中的AMO處理的細胞中的信號

11、銳減觀察點，所有下游的信號，包括外顯子，比控制和SSA處理的樣品一直較低。定義終止點，我們的特點cDNA片段（3中的箭頭表示從這一地區(qū)包括幾個基因的轉錄，表明這種模式從U1的AMO的轉染細胞，NR3C1和STK17A進行測序的3場產品），（圖4a）。令人驚訝的是，這顯示，成績單的poly（A）在3端序列，未發(fā)現在基因組序列，并增加了后轉錄20個核苷酸的一個潛在的polyA信號的下游（PAS），通常AAUAAA（圖4a）。這些結果表明，前體RNA過早切割和一個內含子內加尾時的功能U1snRNP水平降低。提前終止U1的AMO前基因內含子轉染細胞4ID提前終止的前體RNA加尾從內含子中的神秘PASS

12、以確定是否這些假定的通功能相關的，我們構建了NR3C1迷你-2和第3外顯子組成的基因側翼的trancated內含2切割和多聚腺苷酸發(fā)生。相同的質粒也被修建在假定局首席助理局長在第2內含子突變推斷切片陣列（圖4b）。這些質粒的細胞中表達，然后轉染控制或U1的阿莫斯。野生型質粒表達表明在神秘后才功率放大器U1的AMO處理（防落素圖4b），與內源性NR3C1基因的結果一致。無解理和聚腺苷酸發(fā)生在包含一個突變的考績制度成績單控制或U1的AMO的轉染細胞（圖辿），證明這個神秘的考績制度是功能和這個過程是相似的，通常發(fā)生在3末端基因。防落素抑制U1snRNP特定和獨立拼接與U1的AMO,SSA或U2的AM

13、O（普遍表現出剪接抑制平鋪陣列模式類似的福利金;平鋪陣列補充圖1）沒有表現出防落素。為了測試這一點，我們直接使用的oligo（dT）的反向引物，擴增控制，U1或U2的AMO處理的細胞和SSA治療的細胞（的NR3C1和STK17A成績單圖5a）。正如所料，防落素U1的AMO，但沒有或很少看到U2的AMO和SSA治療的細胞，這可能是由于不穩(wěn)定的U1snRNPU2snRNP抑制后具有約束力。有趣的是，防落素仍然發(fā)生在與U1的AMO及公共福利金的同時治療的細胞，表明U1的抑制效果超過剪接抑制（顯性圖雖）我們得出這樣的結論：U1的抑制裂解和多聚腺苷酸化，這不是剪接抑制，它會導致的后果，既不U2的AMO也

14、SSA表明這種效果。圖5U1snRNP抑制過早分裂和聚腺苷酸從附近的一個神秘的考績制度是拼接的獨立和要求堿基配對從卵裂和聚腺苷酸NR3C1U1snRNP枯竭后的微型基因發(fā)生不到400新臺幣，下游5剪接位點，因此，它似乎這5剪接位點配對，U1snRNP基地的功能PAS抑制利用這個神秘的考績制度。為了測試這一點，我們突變的5剪接位點，滅活拼接，缺乏的mRNA（圖5c）。而野生型小型基因治療后，U1的AMO的防落素只表明，在5剪接位點突變體轉染細胞，防落素，甚至與控制啉治療觀察。這表明，U1snRNP基地配對5剪接位點是能夠抑制神秘首席助理秘書長（圖5c）但是，處理的5剪接網站突變體與U1的AMO的

15、結果4倍的增加，在防落素的同樣神秘的考績制度和隨之而來的8倍減少，在聚腺苷酸的成績單的3從在正常的考績制度“結束（圖5C，D）。因此，U1snRNP基地配對序列5剪接位點以外，還抑制防落素。大量潛在U1snRNP約束力的網站在其他網站的內含子的排除鑒定U1snRNP可能抑制過早利用這個PAS（補充圖2）。這些結果表明，從U1的snRNA的5末端與前mRNA配對的基礎上的損失在PCPA的結果，說明1U1snRNP功能以外，其稱為拼接功能獨立。討論這里我們的實驗顯示，在U1snRNP意想不到的功能，防落素和獨立于它在剪接的作用除了保護成績單。由于U1的AMO,般剪接抑制劑，SSA為參考25，而失活

16、的U2snRNP組件SF3b5，2，允許內含子，不夠穩(wěn)定和積累顯著檢測水平時，他們的拼接抑制鑒定。正如所料，圖案觀察U1的AMO和SSA（這是類似U2的AMO）表明，有效地抑制拼接。然而，U1snRNP功能減少了一個額外的和引人注目的效果，導致大多數基因在我們的數據集，全長前體RNA未能出示。我們發(fā)現，這是由于過早分裂和聚腺苷酸從一個神秘的考績制度，通常在一個內含子，并經常在最初的幾個堿基（5KB）從開始的RNA聚合酶II轉錄。一個snRNP非拼接作用已為U2snRNP在先前的研究顯示，組蛋白mRNA的3末形成廿，28U1snRNP抑制防落素的機制，是目前已知的。然而，當它發(fā)生從規(guī)范通，這是以

17、前的意見栓U1snRNP來調節(jié)正常的3結束分裂和多聚腺苷酸化，在過去的外顯子的自然通的能力讓人聯想到29，并可能有共同的特點。例如，在U1snRNP蛋白U1-70K可以直接交互的poly（A）聚合酶（PAP），30，31和抑制多聚腺苷酸化。針對5-U1的snRNAs突變互補附近序列的3-端外顯子的結果，在談話退化的自然首席助理秘書長（500元內），因為卵裂發(fā)生不加聚（A）尾巴，留下易受到3外切酶的成績單32。相當數量的基因，我們的調查，但沒有包括在我們的分析，表明一個外顯子在內含子和外顯子的信號或減少整個U1中的AMO處理的細胞的轉錄。它是可能的裂解，在這些情況下，沒有后續(xù)聚腺苷酸發(fā)生，談話內

18、容，因此正在迅速退化。另外，切割和多聚腺苷酸可能已發(fā)生的轉錄起始位點非常接近，使這些成績單很難察覺。然而，這些方案是在抑制卵裂和整個前體mRNA的多聚腺苷酸類似機械的作用，到現在為止被認為只處理比我們更大的基因數量的mRNA的3結束時，U1snRNP數據集介紹。隨機，規(guī)范PASS（最常AAUAAA或AUUAAA）每2000個核苷酸發(fā)生，雖然在幾個基因的研究，包括NR3C1，STK17A和BASP1的，神秘的傳球被發(fā)現，每500-800NT。5的強烈偏見與防落素，這些基因發(fā)生后，U1snRNP功能擊倒表明，最初的幾個神秘PASS利用。防落素發(fā)生在哪個點，這些記錄也包含了許多神秘的5剪接位點（補充

19、圖2）。我們提出以下的模型來解釋我們的觀察。前體mRNA加工的因素，包括剪接因素，核蛋白的蛋白質，snRNPs和3端切割和多聚腺苷酸化因素共同轉錄與新生的成績單聯營公司33-37。分裂/多聚腺苷酸化的RNA聚合酶IICTD的轉錄延伸復雜的因素，直接的關聯已證實36。U1snRNP聯營公司與新生的成績單，由新生的前體RNA體，包括5剪接位點和神秘的5剪接位點，在神秘的通攻擊前mRNA的抑制卵裂/聚腺苷酸機械與同源序列配對的基地。我們設想，防止U1snRNP的堿基配對時，是在U1AMO轉染細胞的情況下，發(fā)生裂解和多聚腺苷酸可操作在第一局首席助理局長共同轉錄，轉錄延伸復雜的交鋒?？刹僮鞯目伎冎贫?，我

20、們的意思是有必要的六堿基的共識，并在RNP的背景下，對其進行訪問和容易受到攻擊，除非U1snRNP基地附近配對卵裂/聚腺苷酸機械是能夠保護它。我們建議，在正常情況下，這個遭遇強U1的結合位點在終端外顯子的3非編碼區(qū)（5剪接位點或一個神秘的5剪接位點）發(fā)生后，有足夠的密度，因為U1snRNP基地整個保護配對談話到這一點?？稍鰪娬；蛱崆敖K止的可能性存在暫停網站38U1snRNP綁定到5剪接位點，從而起到雙重目的-在剪接和防落素的抑制。U1snRNP的保護區(qū)外圍不知道，但其結合5剪接位點單獨是不太能夠保護大多數內含子，這在人類平均3.4kb的長度39。此外，如果抑制可操作的PASS只能從U1snR

21、NP綁定5剪接位點，5剪接位點突變將預期導致提前終止，而不是，例如，外顯子跳躍，這將是極其有害的，據我們所知，尚未觀察到。額外U1snRNP結合位點，包括神秘的5剪接位點，可作為牽引裂解和內含子中的多聚腺苷酸抑制其活動的地點。從這個角度看，序列稱為神秘的5剪接位點可能成為招聘U1snRNP保護內含子的非拼接的目的。這也是合理的考慮，調節(jié)U1snRNP水平或保護可操作的PASS的網站，在其約束力可能是基因表達調控，包括調控的mRNA或開關從提前終止的前體RNA體產生不同的mRNA表達的機制。我們建議，以防落素的漏洞將有望增加U1snRNP和同源的堿基配對網站，如果沒有可用來保護它的內含子的大小與

22、增加。我們建議，剪接在人體細胞所需的大量過剩的U1snRNP提供額外的關鍵生物功能，以抑制內含子中的防落素和保護完整的轉錄。方法綜述反義寡核苷酸moroholino(AMO)轉染進行電擊。U1和控制阿莫斯(基因工具)序列5-GGTATCTCCCCTGCCAGGTAAGTAT3和5-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA3，分別為23，24。核糖核酸酶H保護法進行了AMO轉染的細胞提取物和反義DNA寡核苷酸為U1snRNA的(5-CAGGTAAGTAT-3)。核糖核酸酶H處理后，RNA樣品進行純化，并與U1snRNA的探針(5-CAAATTATGCAGTCGAGTTTCCCACATT

23、TG-3)由北方雜交分析的U1snRNA的原位雜交與生物素標記的LNA探針(5，GGTATCTCCCCTGCCAGGTAAGTAT-3)。細胞核用DAPI染色。對于在體外拼接,b-32個円標記的UTPAd2AIVS前體RNA準備，如先前所述曲。293T全細胞進行體外剪接反應，如先前所述41提取準備。拼接產品，解決變性PAGE，凝膠放射自顯影。平鋪陣列，基因標記的目標準備和用于Affymetrix的基因芯片人力平鋪2.0RE陣列。陣列進行掃描，產生CEL文件。CEL文件進行分析，使用的Affymetrix的平鋪分析軟件(TAS)的產生。床文件的信號強度和p值。兩個數據集的重疊區(qū)域，選擇使用銀河(

24、httP：/)的煢。我們生產的。為CEL使用助教可視化綜合基因組瀏覽器(Affymetrix公司)的文件。BAR文件。3場，合成cDNA，使用寡核苷酸DT18-XbaKpnBam底漆的總RNA。使用基因特異性正向引物和的XbaKpnBam反向引物進行的第一次和第二次(嵌套)PCR反應。比賽NR3C1微型基因3，將pcDNA3.1-5引物被用來作為第一度底漆的內源性NR3C1RNA，以區(qū)別于微型基因RNA。構建NR3C1迷你基因，內含子1，外顯子2，內含2NR3C1內含2-3外顯子進行擴增和克隆到pcDNA3.1載體DNA片段的NR3C1。這種結構的poly(A)位點和5剪接位點突變。補充表1中

25、列出了所有的引物序列。方法細胞培養(yǎng)和反義嗎啉代寡核苷酸轉染HeLa細胞培養(yǎng)光伏電池previoiusly描述。HeLa細胞（107的轉染細胞）胰酶消化，用PBS洗兩次，并在400無血清DMEM培養(yǎng)液懸浮。嗎啉代寡核苷酸混合細胞后，他們被轉移到一個0.4厘米的差距試管（BIO-RAD）。使用后在960F和280五電在Bio-Rad公司基因脈沖進行電，8小時6孔板細胞培養(yǎng)與2毫升培養(yǎng)液。25-MERU1的AMO的順序是5-GGTATCTCCCCTGCCAGGTAAGTAT的3，這是在人類U1的snRNA的核苷酸1-25互補。25夏季U2AMO的順序是5-TGATAAGAACAGATACTACACT

26、TGA-3，這是在人類的U2樂隊snRNA的核苷酸27-51互補。25夏季炒順序控制AMO是5-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3，如前面所述。阿莫斯從基因的工具，有限責任公司獲得。RNA制備和3比賽從培養(yǎng)細胞，用Trizol（Invitrogen公司）提取總RNA。合成cDNA，根據制造商的指示使用寡核苷酸3場DT18-XbaKpnBam底漆的使用上標III逆轉錄酶（Invitrogen公司）。3賽進行了第一和第二（嵌套）正向引物和XbaKpnBam反向引物。比賽NR3C1微型基因3，將pcDNA3.1-5引物,正向引物作為內源性NR3C1RNA，以區(qū)別于微型基因RNA。

27、酶切PCR產物切割mRNA的拼接，以區(qū)別于過早加尾的RNA的PCR產物和規(guī)范PAS在3端加尾。進行實時PCR定量的防落素和規(guī)范考績制度的多聚腺苷酸化在3控制和U1的AMO處理的細胞（圖昱）。補充表1中列出的引物序列。平鋪陣列目標的準備，雜交和數據分析總RNA，準備從HeLa細胞轉染與控制或U1阿莫斯（7.5M），或公共福利金（100毫微克/毫升）或甲醇為8小時。利用基因芯片聚擴增雙鏈cDNA合成試劑盒和基因芯片的野生雙鏈DNA末端標記試劑盒（Affymetrix公司）的準備，根據制造商的指示標記的cDNA目標。應用基因芯片人力平鋪2.0RE陣列（Affymetrix公司）結束標記的cDNA目標

28、。使用F450-001射流清洗和染色Affymetrix基因450射流站腳本進行雜交。使用Affymetrix公司GCS的30007G基因芯片操作系統軟件（GCOS）的產生。CEL文件進行掃描陣列。為平鋪陣列分析中，我們使用CEL文件的Affymetrix平鋪分析軟件1.1版（TAS）的產生。床以下的信號強度的文件和p值（BW=50，最小運行=100，最大差距=100倍$2倍，P值0.01）。重疊區(qū)域的信號強度和p值的兩個文件，選擇使用銀河（/）。我們生產的。為CEL使用助教可視化綜合基因組瀏覽器（IGB）（Affymetrix公司）的文件。BAR文件。在體外拼接a-32PAd2AIVS前體mRNA的UTP標記準備，如先前所述44。在體外剪接反應進行293T全細胞拼接如前所述提取準備。越來越多的控制和U1的阿莫斯被添加到反應孵育90分鐘，在30C。變性PAGE解決的TRIzol拼接產品進行純化，凝膠放射自顯影。核糖核酸酶H保護法和Northern雜交阿莫斯轉染HeLa