U1 snRNP防止前體mRNA過早切割和多聚腺苷酸化

1、U1snRNP防止前體mRNA過早切割和多聚腺苷酸化在真核生物中，U1小核核糖核蛋白（snRNP）與U2,U4,U5和U6的snRNPs形成平等的化學(xué)計(jì)量學(xué)的剪接；然而，它在人類的豐富度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他snRNPs。在這里，我們用反義嗎啉代寡核苷酸到U1snRNA的實(shí)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中U1snRNP擊倒的功能，并確定基因平鋪芯片累計(jì)未拼接前體RNA。在除了抑制拼接,U1snRNP擊倒造成早產(chǎn)兒在眾多的前體RNA切割和聚腺苷酸在神秘的多聚腺苷酸信號，經(jīng)常在附近（5個堿基）的談話開始的內(nèi)含子。這沒有發(fā)生時，剪接抑制U2snRNA的反義嗎啉代寡核苷酸或U2-snRNP失活的藥物spliceostatin

2、除非U1的反義嗎啉寡核苷酸也被列入。我們進(jìn)一步的研究表明，U1的snRNA的前體mRNA的堿基配對需要抑制位于內(nèi)含子從附近神秘的多聚腺苷酸信號過早分裂和多聚腺苷酸。這些發(fā)現(xiàn)揭示了U1snRNP關(guān)鍵拼接獨(dú)立的功能，在保護(hù)的轉(zhuǎn)錄，我們提出解釋其過多。在真核細(xì)胞中的信使RNA,產(chǎn)生廣泛的轉(zhuǎn)錄后加工的初級轉(zhuǎn)錄（前體RNA），包括5端的封蓋，去除內(nèi)含子的剪接，和3端切割和多聚腺苷酸丄-4。每個剪接反應(yīng)進(jìn)行了1剪接，一個大型的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要由小核的RNPs（snRNPs）5-8。在U1,U2，U4U6和U5的snRNPs的主要（U2類型）剪接的組成部分，而一個更豐富（1）未成年人（U12型）剪

3、接，U12，U11的組成，U4atac,U6atac和U5snRNPs5,9-11。snRNPs,由特定的RNA結(jié)合蛋白的幫助下，認(rèn)識到，由snRNA的前體mRNA的堿基配對，在前體RNA的典型序列定義在主要和次要類內(nèi)含子，包括內(nèi)含子/外顯子交界處的5-3-剪接位點(diǎn)。U1snRNP起著至關(guān)重要的作用定義5由RNA剪接位點(diǎn)：通過5RNA堿基配對的核苷酸序列的U1snRNA的九個。形成剪接的催化核心，snRNPs1:1化學(xué)計(jì)量學(xué)一起作為一個模塊化的機(jī)器5。然而，在細(xì)胞中的各種snRNPs的豐度并不反映在剪接equimolarity。U1snRNP,在10估計(jì)拷貝數(shù)，這是特別引人注目的人體細(xì)胞（He

4、La細(xì)胞），每&分子是在高等真核生物的其他snRNPs豐富得多12。不知道的snRNPs不同金額的潛在作用。我們在探索蜂窩snRNP豐富的潛在功能的興趣源于早先的意見，缺乏生存的運(yùn)動神經(jīng)元（SMN）的蛋白質(zhì)，在snRNP合成的重要組成部分，在孫廿，擾亂正常的細(xì)胞豐度的snRNPs（snRNP劇目）18,*并引起了廣泛的剪接異常。拼接snRNP豐度變化，在一般的SMN缺乏分子后果可能造成的影響是重要的，因?yàn)榈腟MN缺乏是脊肌萎縮癥（SMA）的，往往是致命的運(yùn)動神經(jīng)元退行性疾病的原因，20-22。然而，snRNP劇目的變化發(fā)生在一個缺乏癥SMN-SMA小鼠模型，在不同的組織而異，統(tǒng)一為所有的snR

5、NPs18日，19日，包括雙雙下跌，同時幾個snRNPs水平上調(diào)，使他們很難概括。為了規(guī)避這個問題，我們調(diào)查個別snRNPs功能減少使用反義嗎啉代寡核苷酸（古跡辦）的轉(zhuǎn)錄的影響。我們的實(shí)驗(yàn)顯示為U1snRNP保護(hù)過早切割和多聚腺苷酸（防落素），有別于其在剪接作用的前體RNA意想不到的功能。AMO與U1snRNP功能擊倒U1snRNP功能，以減少數(shù)量，我們設(shè)計(jì)了一個AMO，占地面積5的U1snRNA的（U1的AMO），以阻止其結(jié)合到5剪接位點(diǎn)。以確認(rèn)U1的AMO結(jié)合到U1snRNP和確定抑制它在細(xì)胞所需的金額，我們進(jìn)行了核糖核酸酶H保護(hù)法。從細(xì)胞中提取轉(zhuǎn)同一個加擾控制AMO23，24或核糖核酸酶

6、HU1的AMO的不同濃度培養(yǎng)和反義DNA寡核苷酸探針也補(bǔ)充U1的snRNA的5端序列（圖匕）。觀察一個劑量依賴性下降裂U1的snRNA的金額轉(zhuǎn)U1的AMO的數(shù)量增加（圖1a），U1的AMO，阻止反義DNA寡核苷酸探針結(jié)合，并征求核糖核酸酶H消化。U1snRNA的5在細(xì)胞中的堿基配對完成或接近完成干擾觀察與U1的AMO（7.5微米圖更）。此外，我們使用U1的snRNA的5序列（新臺幣1-25），以確定如果U1的AMO被捆綁在細(xì)胞相同的序列互補(bǔ)與LNA探針原位雜交。圖像（圖1b）顯示，U1的AMO確實(shí)在呈劑量依賴性和盾牌U1的snRNA的5序列，這個序列是完全無法7.5MU1的AMO,U1的AMO

7、的所有后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用的濃度。為了確認(rèn)，U1的AMO抑制U1snRNP的活動，直接，我們在體外拼接測試其效果。在圖1c，U1的AMO,但不是控制AMO,大力減少拼接產(chǎn)品為Ad2AIVS量。因此，U1的AMO的功能滅活U1無論是在體內(nèi)和體外snRNP。U1的AMO結(jié)合到5的U1snRNA的序列，并抑制其剪接活動未拼接的前體RNA的積累后，剪接抑制為了獲得U1snRNP擊倒，包括內(nèi)含子和外顯子上的影響后發(fā)生的轉(zhuǎn)錄變化的全球高分辨率的圖片，我們分析了準(zhǔn)備從要么U1或控制AMOS使用Affymetrix基因芯片人力平鋪2.0RE陣列的轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的總RNA。這種高密度的基因平鋪陣列包括瓷磚探針（

8、25-MER寡核苷酸間隔10NT），5，7和16條染色體，估計(jì)包含3600基因覆蓋整個基因組序列。所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了單獨(dú)的生物一式三份，并處理為8小時，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞恢復(fù)和足夠的信號積累上述背景。作為參考，我們在并行處理的細(xì)胞的強(qiáng)有力的和一般的剪接抑制劑，spliceostatin（SSA），目標(biāo)剪接因子SF3b的，組件的U2樂隊(duì)snRNP25。由于每個前體RNA體量通常是非常小，不易察覺，內(nèi)含信號的大量增加提供未拼接的前體RNA積累的最確切的證據(jù)，以確保相應(yīng)的序列進(jìn)行了積極轉(zhuǎn)錄和其未拼接的成績單是不夠穩(wěn)定要拿下。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定超過以下閾值的顯著變化：倍變化$2,p值0.01和受災(zāi)地區(qū)的長度$

9、100新臺幣（相當(dāng)于3個或更多的連續(xù)探頭）。這確定的319個基因顯示，通常由一個或多個內(nèi)含子中無論U1的AMO（211個基因）或公共福利金（216基因）的積累。從一開始，我們預(yù)期由于剪接抑制兩種模式。一個普遍下降，從談話的所有信號可以反映未拼接的前體RNA體是較穩(wěn)定，并迅速退化，但是，我們并沒有包括在我們的分析，因?yàn)樗麄円部赡軙?dǎo)致轉(zhuǎn)錄的下調(diào)。我們還預(yù)計(jì)，U1的AMO和SSA將顯示整個談話作為一般的剪接抑制內(nèi)含積累類似的模式，但只有98個基因（30.7%）ETF1（例證，這是觀察圖2）。少數(shù)的基因（41個基因;12.9），其他配置文件，但沒有表現(xiàn)出任何連貫的模式然而，出乎意料的是，大多數(shù)基因（

10、180個基因；56.4%）表現(xiàn)出不同的圖案U1的AMO和SSA（HSPA9，SRRM2和CBFB圖2）基因組平鋪陣列識別未拼接的前體RNA繼U1的AMO和spliceostatin（SSA）的治療U1snRNP擊倒導(dǎo)致防落素最顯著，廣大U1的AMO轉(zhuǎn)染細(xì)胞在受影響的基因表明了類似的模式，內(nèi)含強(qiáng)烈的信號，提前終止向公共福利金，例如，在HSPA9，SRRM2和CBFB組成，如圖2中箭頭表示。這通常發(fā)生在內(nèi)含子，在第一季度的基因5具有強(qiáng)大的偏見，為幾個功能在不同的基因圖3所示。值得注意的是，在U1AMO轉(zhuǎn)染細(xì)胞在未拼接內(nèi)含信號的急劇下降，經(jīng)常在3-5KB從談話開始。從U1中的AMO處理的細(xì)胞中的信號

11、銳減觀察點(diǎn)，所有下游的信號，包括外顯子，比控制和SSA處理的樣品一直較低。定義終止點(diǎn)，我們的特點(diǎn)cDNA片段（3中的箭頭表示從這一地區(qū)包括幾個基因的轉(zhuǎn)錄，表明這種模式從U1的AMO的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，NR3C1和STK17A進(jìn)行測序的3場產(chǎn)品），（圖4a）。令人驚訝的是，這顯示，成績單的poly（A）在3端序列，未發(fā)現(xiàn)在基因組序列，并增加了后轉(zhuǎn)錄20個核苷酸的一個潛在的polyA信號的下游（PAS），通常AAUAAA（圖4a）。這些結(jié)果表明，前體RNA過早切割和一個內(nèi)含子內(nèi)加尾時的功能U1snRNP水平降低。提前終止U1的AMO前基因內(nèi)含子轉(zhuǎn)染細(xì)胞4ID提前終止的前體RNA加尾從內(nèi)含子中的神秘PASS

12、以確定是否這些假定的通功能相關(guān)的，我們構(gòu)建了NR3C1迷你-2和第3外顯子組成的基因側(cè)翼的trancated內(nèi)含2切割和多聚腺苷酸發(fā)生。相同的質(zhì)粒也被修建在假定局首席助理局長在第2內(nèi)含子突變推斷切片陣列（圖4b）。這些質(zhì)粒的細(xì)胞中表達(dá)，然后轉(zhuǎn)染控制或U1的阿莫斯。野生型質(zhì)粒表達(dá)表明在神秘后才功率放大器U1的AMO處理（防落素圖4b），與內(nèi)源性NR3C1基因的結(jié)果一致。無解理和聚腺苷酸發(fā)生在包含一個突變的考績制度成績單控制或U1的AMO的轉(zhuǎn)染細(xì)胞（圖辿），證明這個神秘的考績制度是功能和這個過程是相似的，通常發(fā)生在3末端基因。防落素抑制U1snRNP特定和獨(dú)立拼接與U1的AMO,SSA或U2的AM

13、O（普遍表現(xiàn)出剪接抑制平鋪陣列模式類似的福利金;平鋪陣列補(bǔ)充圖1）沒有表現(xiàn)出防落素。為了測試這一點(diǎn)，我們直接使用的oligo（dT）的反向引物，擴(kuò)增控制，U1或U2的AMO處理的細(xì)胞和SSA治療的細(xì)胞（的NR3C1和STK17A成績單圖5a）。正如所料，防落素U1的AMO，但沒有或很少看到U2的AMO和SSA治療的細(xì)胞，這可能是由于不穩(wěn)定的U1snRNPU2snRNP抑制后具有約束力。有趣的是，防落素仍然發(fā)生在與U1的AMO及公共福利金的同時治療的細(xì)胞，表明U1的抑制效果超過剪接抑制（顯性圖雖）我們得出這樣的結(jié)論：U1的抑制裂解和多聚腺苷酸化，這不是剪接抑制，它會導(dǎo)致的后果，既不U2的AMO也

14、SSA表明這種效果。圖5U1snRNP抑制過早分裂和聚腺苷酸從附近的一個神秘的考績制度是拼接的獨(dú)立和要求堿基配對從卵裂和聚腺苷酸NR3C1U1snRNP枯竭后的微型基因發(fā)生不到400新臺幣，下游5剪接位點(diǎn)，因此，它似乎這5剪接位點(diǎn)配對，U1snRNP基地的功能PAS抑制利用這個神秘的考績制度。為了測試這一點(diǎn)，我們突變的5剪接位點(diǎn)，滅活拼接，缺乏的mRNA（圖5c）。而野生型小型基因治療后，U1的AMO的防落素只表明，在5剪接位點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，防落素，甚至與控制啉治療觀察。這表明，U1snRNP基地配對5剪接位點(diǎn)是能夠抑制神秘首席助理秘書長（圖5c）但是，處理的5剪接網(wǎng)站突變體與U1的AMO的

15、結(jié)果4倍的增加，在防落素的同樣神秘的考績制度和隨之而來的8倍減少，在聚腺苷酸的成績單的3從在正常的考績制度“結(jié)束（圖5C，D）。因此，U1snRNP基地配對序列5剪接位點(diǎn)以外，還抑制防落素。大量潛在U1snRNP約束力的網(wǎng)站在其他網(wǎng)站的內(nèi)含子的排除鑒定U1snRNP可能抑制過早利用這個PAS（補(bǔ)充圖2）。這些結(jié)果表明，從U1的snRNA的5末端與前mRNA配對的基礎(chǔ)上的損失在PCPA的結(jié)果，說明1U1snRNP功能以外，其稱為拼接功能獨(dú)立。討論這里我們的實(shí)驗(yàn)顯示，在U1snRNP意想不到的功能，防落素和獨(dú)立于它在剪接的作用除了保護(hù)成績單。由于U1的AMO,般剪接抑制劑，SSA為參考25，而失活

16、的U2snRNP組件SF3b5，2，允許內(nèi)含子，不夠穩(wěn)定和積累顯著檢測水平時，他們的拼接抑制鑒定。正如所料，圖案觀察U1的AMO和SSA（這是類似U2的AMO）表明，有效地抑制拼接。然而，U1snRNP功能減少了一個額外的和引人注目的效果，導(dǎo)致大多數(shù)基因在我們的數(shù)據(jù)集，全長前體RNA未能出示。我們發(fā)現(xiàn)，這是由于過早分裂和聚腺苷酸從一個神秘的考績制度，通常在一個內(nèi)含子，并經(jīng)常在最初的幾個堿基（5KB）從開始的RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄。一個snRNP非拼接作用已為U2snRNP在先前的研究顯示，組蛋白mRNA的3末形成廿，28U1snRNP抑制防落素的機(jī)制，是目前已知的。然而，當(dāng)它發(fā)生從規(guī)范通，這是以

17、前的意見栓U1snRNP來調(diào)節(jié)正常的3結(jié)束分裂和多聚腺苷酸化，在過去的外顯子的自然通的能力讓人聯(lián)想到29，并可能有共同的特點(diǎn)。例如，在U1snRNP蛋白U1-70K可以直接交互的poly（A）聚合酶（PAP），30，31和抑制多聚腺苷酸化。針對5-U1的snRNAs突變互補(bǔ)附近序列的3-端外顯子的結(jié)果，在談話退化的自然首席助理秘書長（500元內(nèi)），因?yàn)槁蚜寻l(fā)生不加聚（A）尾巴，留下易受到3外切酶的成績單32。相當(dāng)數(shù)量的基因，我們的調(diào)查，但沒有包括在我們的分析，表明一個外顯子在內(nèi)含子和外顯子的信號或減少整個U1中的AMO處理的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄。它是可能的裂解，在這些情況下，沒有后續(xù)聚腺苷酸發(fā)生，談話內(nèi)

18、容，因此正在迅速退化。另外，切割和多聚腺苷酸可能已發(fā)生的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)非常接近，使這些成績單很難察覺。然而，這些方案是在抑制卵裂和整個前體mRNA的多聚腺苷酸類似機(jī)械的作用，到現(xiàn)在為止被認(rèn)為只處理比我們更大的基因數(shù)量的mRNA的3結(jié)束時，U1snRNP數(shù)據(jù)集介紹。隨機(jī)，規(guī)范PASS（最常AAUAAA或AUUAAA）每2000個核苷酸發(fā)生，雖然在幾個基因的研究，包括NR3C1，STK17A和BASP1的，神秘的傳球被發(fā)現(xiàn)，每500-800NT。5的強(qiáng)烈偏見與防落素，這些基因發(fā)生后，U1snRNP功能擊倒表明，最初的幾個神秘PASS利用。防落素發(fā)生在哪個點(diǎn)，這些記錄也包含了許多神秘的5剪接位點(diǎn)（補(bǔ)充

19、圖2）。我們提出以下的模型來解釋我們的觀察。前體mRNA加工的因素，包括剪接因素，核蛋白的蛋白質(zhì)，snRNPs和3端切割和多聚腺苷酸化因素共同轉(zhuǎn)錄與新生的成績單聯(lián)營公司33-37。分裂/多聚腺苷酸化的RNA聚合酶IICTD的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)雜的因素，直接的關(guān)聯(lián)已證實(shí)36。U1snRNP聯(lián)營公司與新生的成績單，由新生的前體RNA體，包括5剪接位點(diǎn)和神秘的5剪接位點(diǎn)，在神秘的通攻擊前mRNA的抑制卵裂/聚腺苷酸機(jī)械與同源序列配對的基地。我們設(shè)想，防止U1snRNP的堿基配對時，是在U1AMO轉(zhuǎn)染細(xì)胞的情況下，發(fā)生裂解和多聚腺苷酸可操作在第一局首席助理局長共同轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)雜的交鋒?？刹僮鞯目伎冎贫龋?/p>

20、們的意思是有必要的六堿基的共識，并在RNP的背景下，對其進(jìn)行訪問和容易受到攻擊，除非U1snRNP基地附近配對卵裂/聚腺苷酸機(jī)械是能夠保護(hù)它。我們建議，在正常情況下，這個遭遇強(qiáng)U1的結(jié)合位點(diǎn)在終端外顯子的3非編碼區(qū)（5剪接位點(diǎn)或一個神秘的5剪接位點(diǎn)）發(fā)生后，有足夠的密度，因?yàn)閁1snRNP基地整個保護(hù)配對談話到這一點(diǎn)。可增強(qiáng)正?；蛱崆敖K止的可能性存在暫停網(wǎng)站38U1snRNP綁定到5剪接位點(diǎn)，從而起到雙重目的-在剪接和防落素的抑制。U1snRNP的保護(hù)區(qū)外圍不知道，但其結(jié)合5剪接位點(diǎn)單獨(dú)是不太能夠保護(hù)大多數(shù)內(nèi)含子，這在人類平均3.4kb的長度39。此外，如果抑制可操作的PASS只能從U1snR

21、NP綁定5剪接位點(diǎn)，5剪接位點(diǎn)突變將預(yù)期導(dǎo)致提前終止，而不是，例如，外顯子跳躍，這將是極其有害的，據(jù)我們所知，尚未觀察到。額外U1snRNP結(jié)合位點(diǎn)，包括神秘的5剪接位點(diǎn)，可作為牽引裂解和內(nèi)含子中的多聚腺苷酸抑制其活動的地點(diǎn)。從這個角度看，序列稱為神秘的5剪接位點(diǎn)可能成為招聘U1snRNP保護(hù)內(nèi)含子的非拼接的目的。這也是合理的考慮，調(diào)節(jié)U1snRNP水平或保護(hù)可操作的PASS的網(wǎng)站，在其約束力可能是基因表達(dá)調(diào)控，包括調(diào)控的mRNA或開關(guān)從提前終止的前體RNA體產(chǎn)生不同的mRNA表達(dá)的機(jī)制。我們建議，以防落素的漏洞將有望增加U1snRNP和同源的堿基配對網(wǎng)站，如果沒有可用來保護(hù)它的內(nèi)含子的大小與

22、增加。我們建議，剪接在人體細(xì)胞所需的大量過剩的U1snRNP提供額外的關(guān)鍵生物功能，以抑制內(nèi)含子中的防落素和保護(hù)完整的轉(zhuǎn)錄。方法綜述反義寡核苷酸moroholino(AMO)轉(zhuǎn)染進(jìn)行電擊。U1和控制阿莫斯(基因工具)序列5-GGTATCTCCCCTGCCAGGTAAGTAT3和5-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA3，分別為23，24。核糖核酸酶H保護(hù)法進(jìn)行了AMO轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取物和反義DNA寡核苷酸為U1snRNA的(5-CAGGTAAGTAT-3)。核糖核酸酶H處理后，RNA樣品進(jìn)行純化，并與U1snRNA的探針(5-CAAATTATGCAGTCGAGTTTCCCACATT

23、TG-3)由北方雜交分析的U1snRNA的原位雜交與生物素標(biāo)記的LNA探針(5，GGTATCTCCCCTGCCAGGTAAGTAT-3)。細(xì)胞核用DAPI染色。對于在體外拼接,b-32個円標(biāo)記的UTPAd2AIVS前體RNA準(zhǔn)備，如先前所述曲。293T全細(xì)胞進(jìn)行體外剪接反應(yīng)，如先前所述41提取準(zhǔn)備。拼接產(chǎn)品，解決變性PAGE，凝膠放射自顯影。平鋪陣列，基因標(biāo)記的目標(biāo)準(zhǔn)備和用于Affymetrix的基因芯片人力平鋪2.0RE陣列。陣列進(jìn)行掃描，產(chǎn)生CEL文件。CEL文件進(jìn)行分析，使用的Affymetrix的平鋪分析軟件(TAS)的產(chǎn)生。床文件的信號強(qiáng)度和p值。兩個數(shù)據(jù)集的重疊區(qū)域，選擇使用銀河(

24、httP：/)的煢。我們生產(chǎn)的。為CEL使用助教可視化綜合基因組瀏覽器(Affymetrix公司)的文件。BAR文件。3場，合成cDNA，使用寡核苷酸DT18-XbaKpnBam底漆的總RNA。使用基因特異性正向引物和的XbaKpnBam反向引物進(jìn)行的第一次和第二次(嵌套)PCR反應(yīng)。比賽NR3C1微型基因3，將pcDNA3.1-5引物被用來作為第一度底漆的內(nèi)源性NR3C1RNA，以區(qū)別于微型基因RNA。構(gòu)建NR3C1迷你基因，內(nèi)含子1，外顯子2，內(nèi)含2NR3C1內(nèi)含2-3外顯子進(jìn)行擴(kuò)增和克隆到pcDNA3.1載體DNA片段的NR3C1。這種結(jié)構(gòu)的poly(A)位點(diǎn)和5剪接位點(diǎn)突變。補(bǔ)充表1中

25、列出了所有的引物序列。方法細(xì)胞培養(yǎng)和反義嗎啉代寡核苷酸轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞培養(yǎng)光伏電池previoiusly描述。HeLa細(xì)胞（107的轉(zhuǎn)染細(xì)胞）胰酶消化，用PBS洗兩次，并在400無血清DMEM培養(yǎng)液懸浮。嗎啉代寡核苷酸混合細(xì)胞后，他們被轉(zhuǎn)移到一個0.4厘米的差距試管（BIO-RAD）。使用后在960F和280五電在Bio-Rad公司基因脈沖進(jìn)行電，8小時6孔板細(xì)胞培養(yǎng)與2毫升培養(yǎng)液。25-MERU1的AMO的順序是5-GGTATCTCCCCTGCCAGGTAAGTAT的3，這是在人類U1的snRNA的核苷酸1-25互補(bǔ)。25夏季U2AMO的順序是5-TGATAAGAACAGATACTACACT

26、TGA-3，這是在人類的U2樂隊(duì)snRNA的核苷酸27-51互補(bǔ)。25夏季炒順序控制AMO是5-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3，如前面所述。阿莫斯從基因的工具，有限責(zé)任公司獲得。RNA制備和3比賽從培養(yǎng)細(xì)胞，用Trizol（Invitrogen公司）提取總RNA。合成cDNA，根據(jù)制造商的指示使用寡核苷酸3場DT18-XbaKpnBam底漆的使用上標(biāo)III逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司）。3賽進(jìn)行了第一和第二（嵌套）正向引物和XbaKpnBam反向引物。比賽NR3C1微型基因3，將pcDNA3.1-5引物,正向引物作為內(nèi)源性NR3C1RNA，以區(qū)別于微型基因RNA。

27、酶切PCR產(chǎn)物切割mRNA的拼接，以區(qū)別于過早加尾的RNA的PCR產(chǎn)物和規(guī)范PAS在3端加尾。進(jìn)行實(shí)時PCR定量的防落素和規(guī)范考績制度的多聚腺苷酸化在3控制和U1的AMO處理的細(xì)胞（圖昱）。補(bǔ)充表1中列出的引物序列。平鋪陣列目標(biāo)的準(zhǔn)備，雜交和數(shù)據(jù)分析總RNA，準(zhǔn)備從HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染與控制或U1阿莫斯（7.5M），或公共福利金（100毫微克/毫升）或甲醇為8小時。利用基因芯片聚擴(kuò)增雙鏈cDNA合成試劑盒和基因芯片的野生雙鏈DNA末端標(biāo)記試劑盒（Affymetrix公司）的準(zhǔn)備，根據(jù)制造商的指示標(biāo)記的cDNA目標(biāo)。應(yīng)用基因芯片人力平鋪2.0RE陣列（Affymetrix公司）結(jié)束標(biāo)記的cDNA目標(biāo)

28、。使用F450-001射流清洗和染色Affymetrix基因450射流站腳本進(jìn)行雜交。使用Affymetrix公司GCS的30007G基因芯片操作系統(tǒng)軟件（GCOS）的產(chǎn)生。CEL文件進(jìn)行掃描陣列。為平鋪陣列分析中，我們使用CEL文件的Affymetrix平鋪分析軟件1.1版（TAS）的產(chǎn)生。床以下的信號強(qiáng)度的文件和p值（BW=50，最小運(yùn)行=100，最大差距=100倍$2倍，P值0.01）。重疊區(qū)域的信號強(qiáng)度和p值的兩個文件，選擇使用銀河（/）。我們生產(chǎn)的。為CEL使用助教可視化綜合基因組瀏覽器（IGB）（Affymetrix公司）的文件。BAR文件。在體外拼接a-32PAd2AIVS前體mRNA的UTP標(biāo)記準(zhǔn)備，如先前所述44。在體外剪接反應(yīng)進(jìn)行293T全細(xì)胞拼接如前所述提取準(zhǔn)備。越來越多的控制和U1的阿莫斯被添加到反應(yīng)孵育90分鐘，在30C。變性PAGE解決的TRIzol拼接產(chǎn)品進(jìn)行純化，凝膠放射自顯影。核糖核酸酶H保護(hù)法和Northern雜交阿莫斯轉(zhuǎn)染HeLa