分子生物實(shí)驗(yàn)課件：5 斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

1、斑點(diǎn)印跡雜交 掌握斑點(diǎn)印跡雜交的原理及方法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾s交：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。斑點(diǎn)雜交：是指將待測的DNA變形后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜）上，用已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，洗膜（除去未結(jié)合的探針），放射自顯影，判斷是否有雜交或其雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。根據(jù)點(diǎn)樣磨具不同，點(diǎn)樣形狀呈圓形稱為斑點(diǎn)雜交，呈狹縫形則稱為狹縫雜交。實(shí)驗(yàn)原理 斑點(diǎn)印跡雜交不需要電泳和轉(zhuǎn)移，雜交過程包括點(diǎn)樣，變性，中和，干燥固定，預(yù)雜交，雜交，封閉，檢測雜交結(jié)果等步驟，相對south

2、ern印跡雜交和Northern印記雜交來說快，適合于同時(shí)分析多個(gè)樣品。實(shí)驗(yàn)步驟：變性：按8:1將80ul ddH2O加入至10ul待測DNA樣品中，稀釋樣品。100加熱10min后，立即置于冰中5min（使DNA變性），加入90ul 20SSC混勻。點(diǎn)樣：將上述變性后的樣品180ul點(diǎn)在尼龍膜的毛面上，真空抽濾，室溫下風(fēng)干后，于烤箱中120烘烤15min。使變性的DNA與膜結(jié)合牢固預(yù)雜交：將膜封入15ml離心管中，做好剪角標(biāo)記。加入預(yù)雜交液3ml。置42恒溫?fù)u床上，輕輕振搖30min。封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)雜交：加入探針3ml（生物素-DNA），置42 恒溫床上，輕輕振蕩1

3、-2h。變性DNA與探針結(jié)合5 洗膜：倒掉雜交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1預(yù)熱到42），每次5min；再將洗液2 (每次5ml）洗膜兩次（預(yù)熱到42），每次15min。洗去未結(jié)合的探針，否則本底會(huì)太高6 封閉：倒掉洗液2，加入5ml封閉液，37作用15min。封閉雜交膜上非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)7 酶聯(lián)抗體結(jié)合：倒掉封閉液，加入3ml親和素-辣根過氧化物酶（HRP），于37輕輕振搖30min。酶聯(lián)抗體與生物素結(jié)合8 洗膜：倒掉第七步驟中液體，加入5ml洗液3，洗膜三次，每次2-3min。洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體9 顯色：洗膜后，加3ml的顯色液避光顯色1-2min，斑點(diǎn)出來后就可倒掉顯色液，用