腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗步驟實驗原理及步驟

1、實驗二十一 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗步驟一、實驗?zāi)康?了解培養(yǎng)基母液的配制方法和注意事項；掌握培養(yǎng)基的配制和滅菌方法，掌握動物細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法二、實驗原理（一）、實驗用具的清洗1、玻璃器皿的清洗組織細(xì)胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。（1）浸泡：新瓶使用前應(yīng)先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。（2）刷

2、洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。（3）浸酸：浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應(yīng)少于6小時。（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用。 2、膠塞的清洗 先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自

3、來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。3、塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2% NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。（二）、滅菌和消毒培養(yǎng)液、橡膠制品、10磅10分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。（三）、培養(yǎng)基的配制1、平衡鹽溶液（BSS）主要是由無機鹽和葡萄糖組成。BSS中的無機離子是細(xì)胞生命的必要成分，在維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液pH方面也起著重要作用，另外，Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提

4、供條件，也是細(xì)胞膜的重要組成成分。葡萄糖等為細(xì)胞代謝提供能量。作為核酸分子的合成也需要S、P等作為基質(zhì)。BSS內(nèi)還含有少量的酚紅，作為pH變化的指示劑，溶液變酸性時呈黃包，變堿性時呈紫紅色，中性時呈桃紅色以此觀察和判定培養(yǎng)液pH的變化。目前最常用的BSS是Hanks液、Earle液和PBS等。在細(xì)胞培養(yǎng)中，BSS主要有如下用途： (1)作為配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液： (2)配制各種試液：如配“胰酶”消化液。(3)用于洗滌經(jīng)織和細(xì)胞。Hanks培養(yǎng)液：為了便于保存和減少有關(guān)成分的化學(xué)反應(yīng)，此液可配成10倍濃縮液(10 x)的儲存液(母液)。其配制方法如下： = 1 * GB2 、10 x母液配制法

5、甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列試劑 NaCl 80g KCl 4g MgS047H20 2g CaCl2 1.48(2H20則1.85g) CaCl2應(yīng)單獨溶解后，再混合；待完全溶解后，補足三蒸水至500m1。 乙液；取450ml三蒸水依次溶解下列試劑Na2HP04 0.6g(12H2O則1.528g)KH2P04 0.6g葡萄糖 10g0.4酚紅 50 ml應(yīng)先配好04酚紅溶液待用。配制方法如下：稱取0.4g酚紅，置玻璃研缽個細(xì)研，逐漸加入O.2mol/L的Na0H邊滴邊研至酚紅完全溶解，記好加 NaoH的量，共加至1228m1為止，將研好的酚紅液用吸管移人燒瓶個加三蒸水88.72m1

6、。 = 2 * GB2 、Hanks工作液配制法取上述甲、乙液等量用三蒸水稀釋10倍，即成使用液。用67.6kPa高壓滅菌15min。臨用前，用7.5NaHCO3調(diào)至所需pH。2、PH調(diào)整液。為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時間，在配制營養(yǎng)液時都不預(yù)先加入NaHC03，而在使用前再加人。因此NaHC03都是單獨配制高壓滅菌。合成培養(yǎng)基大都呈弱酸性，而細(xì)胞生長的最適PH為7.07.2，可忍耐的pH范圍是PH6.67.8。pH到7.6時，細(xì)胞雖有代謝但不再分裂增殖，故使用培養(yǎng)基時要調(diào)整PH，并注意培養(yǎng)過程中的pH變化，以及時換液。常用的pH調(diào)整液NaHCO3配制如下：常用的濃度有7.4，5.6，3.7三

7、種；配制時用三蒸水溶解后，濾過除茵，分裝小瓶蓋緊瓶塞，于4或室溫保存；有的實驗室用68kPa，10min高壓滅菌，雖有部分NaHC03被破壞，但操作簡單方便。調(diào)節(jié)PH時，NaHC03要逐滴加入，并不時搖動培養(yǎng)液，以防止加人過量。當(dāng)PH值過高后，可用滅菌的10醋酸溶液或通人C02氣體調(diào)節(jié)。3、合成培養(yǎng)基(Synthetic media)是根據(jù)研究和了解細(xì)胞所需成分的基礎(chǔ)上配制而成的，現(xiàn)已成為普遍應(yīng)用的商品化的培養(yǎng)基；但合成培養(yǎng)基尚未成為十分完全的培養(yǎng)基。它只能維持細(xì)胞不死，但不能促進細(xì)胞增殖生長使用時尚需添加天然培養(yǎng)基，主要是牛血清。目前常用的合成培養(yǎng)基主要是MEM、Eagle培養(yǎng)液和RPMl1

8、640培養(yǎng)液還有199培養(yǎng)液。RPMl1640配制方法：取一袋RPMll640(日本產(chǎn)104g袋，德國產(chǎn)105g袋粉劑溶于950ml三蒸水中，加2.0g NaHCO3，充分?jǐn)嚢枋雇耆芙?，用三蒸水定容至I000m1，用1molL NaOH或HCl調(diào)pH至6.87.0，濾過除菌(pH升至7.07.2)，分裝后干4或20保存?zhèn)溆谩?、消化液。1和0.25胰蛋白酶溶液的配制方法：1)將DHanks溶液用5.6NaHC03調(diào)至pH7.2左右。2)稱取胰酶粉末l克于燒杯中，選用少許平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足至100m1，攪拌均勻，置室溫4小時或冰箱內(nèi)過夜，并不時攪拌振蕩。3)選用濾紙過濾，再用無菌玻璃濾

9、器(G6)或蔡氏濾器(EKS2、EKS3)濾過除菌，按5m1(或Iml)量分裝小瓶，蓋緊瓶蓋，置低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?)臨用時將其用DHanks液稀釋成1：4(即1份胰酶加3份BSS)，即得到025的胰蛋白酶溶液。胰酶溶液較酸，使用前再用56的NaHC03調(diào)pH至72左右。5、抗生素液。 = 1 * GB2 配制：以青霉素、鏈霉素為例，配制如下：青霉素（鈉鹽）100萬u鏈霉素（雙氫）1g（1000 000g）溶于無菌三蒸水100ml，每毫升含青霉素10000u，鏈霉素10000g = 2 * GB2 保存：分裝小瓶，20冰凍保存。 = 3 * GB2 使用：99ml培養(yǎng)液中加入青、鏈霉素混合液1

10、m1最終濃度為青霉素100u/ml，鏈霉素100gml。 6、生長液。在使用合成培養(yǎng)基時，仍需要加入一些天然成分如人或動物血清，血漿和胎汁等，否則細(xì)胞不能很好生長。當(dāng)前主要使用血清，以牛血清為主。血清的生物效應(yīng)早已證明，它含有多種促進細(xì)胞生長、貼附的活性物質(zhì)。合成培養(yǎng)基中不加血清或低濃度(如2)血清，僅能維持細(xì)胞生存，細(xì)胞不能很好生長，這種培養(yǎng)基稱為維持液。加入5的血清，對大多數(shù)細(xì)胞來說，能維持不死和緩慢生長。一般需加入1020血清，有利于細(xì)胞生長，稱為生長液。添加血清，雖利于細(xì)胞生長，但不明成分也增多了，對分析實驗結(jié)果增加了困難。RPMI1640生長液和維持液配法生長液：RPMI1640 8

11、9小牛血清 10雙抗 1用56NaHC03調(diào)pH至70三、實驗操作 1、培養(yǎng)前準(zhǔn)備 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤歷將共放置操作場所(培養(yǎng)室、題凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這樣可以避免開始實驗后因物品不全往返拿取而增加f5染機會。2、培養(yǎng)室和超凈臺的消毒 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2的新潔而滅或25來蘇兒拖洗地面一次(拖把要專用)紫外線照射3050分鐘。超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線照射30分鐘。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)飽和培養(yǎng)液同時照射紫外線。消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置。否則會遮擋

12、射線降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸：、污物盆、試管架等用75酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線照射消毒。3、洗手和著裝 進入無菌培養(yǎng)室原則上必須徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝無菌服、帽子和口罩每次實驗后都要清洗消毒，開始操作前要用75酒精或0.2新潔爾滅航天消毒手和前臂。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿經(jīng)紫外線照射30分鐘的一般清潔工作服。培養(yǎng)室外最好準(zhǔn)備好幾套這樣的工作服，便于隨時進入培養(yǎng)室穿用。4、無菌培養(yǎng)操作 為保證做到無菌，除實驗中所用物品需事先消毒外，在實驗中還需保持無茵操作。因此在進行實驗前，要點燃酒精燈或煤氣

13、燈，一切操作如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時間燒灼，以防退火。燒過的器械要冷卻后才能使用，如鑷子應(yīng)冷卻后才能挾取組織，否則可能造成組織細(xì)胞損傷；己吸過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)液如蛋白質(zhì)等燒焦后會產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時會將其帶到培養(yǎng)基中。開啟、關(guān)閉長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短防止因溫度過高燒死細(xì)胞。另外膠塞、橡皮乳頭過火焰時也不能時間過長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體危害培養(yǎng)細(xì)胞。 工作臺面上的用品要放置有序、布局合理，一般說酒精燈在當(dāng)中，右手使用的物品在右側(cè)，左手使用得物品在左側(cè)。工作忌忙亂而要有順序。

14、織織、細(xì)胞及培養(yǎng)瓶在未做處理和使用前，不要過早暴露于空氣中。應(yīng)分別使用不同吸管吸取營養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液。而不能混用。用吸管、注射器進行轉(zhuǎn)移液體操作時，吸管、注射器針頭不能觸及瓶口以防止細(xì)菌污染或細(xì)胞的交叉污染。培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液瓶不要過早打開，已開口者要盡量避免垂直放置以防止下落細(xì)菌的污染。放置吸管時管口向下傾斜，以防止液體倒流入乳頭內(nèi)引起污染。進行培養(yǎng)操作時，不要用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰燒灼或取備用品更換。面向操作臺時勿大聲講話或咳嗽，以免噴出的唾沫把細(xì)菌等帶入工作臺面發(fā)生污染。5、消化傳代(1)、采用普通消化傳代方法將0.25胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次，每次加1m1(25m1培養(yǎng)瓶)，稍加搖動讓胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面，然后倒掉。(2)、蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)