骨髓基質(zhì)細胞移植對心肌梗塞心肌羥脯氨酸表達

1、骨髓基質(zhì)細胞移植對心肌堵塞心肌羥脯氨酸表達【摘要】目的：評價骨髓基質(zhì)細胞移植對組織羥脯氨酸(hyp)含量的影響，討論細胞移植對心肌堵塞后心室重塑機制。方法：30只日本大耳白兔，隨機分為骨髓基質(zhì)細胞(s)組、安體舒通組、對照組。體外穿刺提取骨髓,別離、培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞，s組、對照組心肌堵塞模型制作成功2周后沿堵塞周邊區(qū)域注射骨髓基質(zhì)細胞懸液(3109/100l)或de培養(yǎng)基100l，安體舒通組模型制作成功后服用安體舒通20g。心臟超聲評價心功能，測定血漿、心肌組織hyp含量、基質(zhì)金屬蛋白酶(p-9)含量，以氯化四唑(tt)染色評價堵塞面積。結(jié)果：與對照組、安體舒通組相比，s組心功能進步lvef:

2、(53.222.13)%(56.912.04)%(62.612.37)，p0.05;堵塞面積下降:(29.732.11)%(28.611.24)%(22.823.12)%，p0.05;血漿hyp含量(g/l)顯著下降(40.162.31)(34.241.98)(22.791.69)，p0.05;心肌組織hyp含量(g/g濕重)顯著下降(3.590.19)(2.670.81)(1.590.89)，p0.05;血基質(zhì)金屬蛋白酶含量(p-9，g/l)顯著增加(218.64115.23)(248.16103.9)(719.25312.2)，p0.05。結(jié)論：細胞移植可抑制組織羥脯氨酸合成，促進基質(zhì)金屬

3、蛋白酶表達，增加心肌膠原降解，說明干細胞移植可抑制心肌膠原合成、抑制心肌部分間質(zhì)纖維化，是細胞移植心功能改善機制之一?！娟P(guān)鍵詞】骨髓移植;心室重構(gòu);羥脯氨酸abstrat：bjetive:tassesstheeffetfarrstraelltransplantatinnnstitutinhydrxyprlinefyardialinfartininrabbit.ethds:islatedssfr30rabbitsbybnearrpuntureereulturedinellulture.elliplantednteeksaftertheleftanterirdesendingbranhasliga

4、ted.rabbitsasdividedintntrlgrup,antisternegrupandelliplantedgrup.the100lderellsuspensinasinjetedintthebrderareafyardialinfartin.theheartfuntinasassessedbyehardigraphybefreandafterelliplanted4eeks.theareafinfartinereestiatedbytt.thenstitutinhydrxyprlineandp-9ereestiated.results:paredithntrlgrupandant

5、isternegrup,ardiafuntinaeliratedlvef:(53.222.13)%vs.(56.912.04)%vs.(62.612.37)%，p0.05;theareafinfartin(29.732.11)%vs.(28.611.24)%vs.(22.823.12)%，p0.05;plasahydrxyprlineredued(40.162.31)vs.(34.241.98)vs.(22.791.69)，p0.05,andnstitutinhydrxyprlinealsredued(3.590.19)vs.(2.670.81)vs.(1.590.89)，p0.05;thep

6、-9inreased(218.64115.23)vs.(248.16103.9)vs.(719.25312.2)，p0.05insgrup.nlusin:theresultshthatesenhyalsteellstransplantatinanbviuslyaelirateardiafuntin,dereaseinfartinareaandyardiufibrsis.keyrds：bnearrtransplantatin;ventriularredeling;hydrxyprline心肌堵塞(i)后心肌間質(zhì)纖維化是心室重塑重要因素，更是堵塞后心衰、惡性心律失常等心血管事件發(fā)生的病理生理基矗傳

7、統(tǒng)藥物、介入手術(shù)對心室重塑療效有限。研究發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細胞(arrstraalell，s)移植可改善心功能、心室重塑，其機制尚不明確。心肌羥脯氨酸(hydrxyprline,hyp)是心肌膠原合成標志物之一。本研究觀察s移植對i后hyp表達的影響，討論細胞移植對i后心肌間質(zhì)纖維化的影響。1資料與方法1.1一般資料35月齡日本大耳白兔30只(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體重22.5kg，雌雄不限，隨機分為對照組、安體舒通藥物治療組及細胞移植組。胎牛血清(hylne公司)，de培養(yǎng)基(hylne公司)，perll別離液(siga公司)，氯化四唑(2，3，5-triphenyltetrazliu

8、hlrid，tt，上海捷倍思基因技術(shù))。相差顯微鏡(lypusx170，日本)，彩色多普勒診斷儀(diasnisgateayfax，美國)，北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)(hpias-1000)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成工程研究所，中國)。1.2方法1.2.1兔骨髓基質(zhì)細胞(s)別離培養(yǎng)：見參考文獻1。1.2.2細胞移植：以10%烏拉坦經(jīng)耳緣作靜脈麻醉，結(jié)扎前降支，制作i模型。2周后，s組、對照組分別沿堵塞周邊區(qū)域隨機選取6個位點依次等量注射細胞懸液或de培養(yǎng)基100l(其中5107細胞/位點)，每一實驗動物部分移植的細胞總數(shù)量3109。安體舒通組給予安體舒通20g，2次/d，服用1月。1.2.3心

9、功能、心室重塑評估:細胞移植前、后4周，彩色多普勒超聲檢查。測定左室收縮末期內(nèi)徑(lvesd)、左室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左室后壁厚度(lvph)，左室短軸縮短率(fs)，每搏輸出量(sv)，左室射血分數(shù)(lvef)等。1.2.4堵塞面積評估：細胞移植后4周處死動物，自左室心尖至心底每2連續(xù)切片5張，置入2%tt溶液，37溫箱染色30in。圖象分析儀計算堵塞區(qū)域在各層心肌中所占比例，重復(fù)3次，取平均值，即為堵塞面積。1.2.5血漿、組織羥脯氨酸含量測定：以樣本堿水解法測定血漿、組織hyp含量。分別于耳緣靜脈取血0.5l及堵塞區(qū)域取3小塊左室堵塞心肌組織檢測血漿、組織hyp含量，測定濕重3

10、0100g，置入玻璃試管，加1l水解液，混勻，95水解20in，流水冷卻加指示劑1滴，依次參加調(diào)ph甲乙液，使ph值維持在66.8，取34l稀釋水解液加適量活性炭，混勻，3500r/in，離心10in，取上清液1l，依次參加hyp試劑1，2，3各0.5l，并混勻靜置5in，60水浴15in，冷卻后，3500轉(zhuǎn)/in，離心10in，取上清液在550n處，1光徑，蒸餾調(diào)零，測定空白管及標準管、測定管吸光度。組織hyp含量(g/g濕重)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)標準管含量(5g/l)水解液總體積(10l)/組織濕重(g);血漿hyp含量(g/l)=(測定管吸光度

11、-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)標準管含量(5g/l)水解液總體積(l)/取樣量(l)。1.2.6基質(zhì)金屬蛋白酶(p-9)檢測：采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)，試劑盒(huenp-9kit1quantikine)為美國rdsyste公司提供，質(zhì)量濃度單位為g/l，靈敏度為0.156g/l。1.3統(tǒng)計學(xué)處理由spss10.0統(tǒng)計軟件完成，計量資料以均數(shù)標準差(s)表示，采用單因素方差分析、q檢驗，p0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1細胞培養(yǎng)剛接種的細胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液。第34d可見少量單個核細胞貼壁，呈梭形或索條形，分布不均，612d貼壁細胞逐漸增多，部分呈巢狀生長，形

12、成多個成纖維樣細胞集落，1620d細胞逐漸聚集成片可以傳代。2.2心臟超聲結(jié)果評價與對照組相比，s組、安體舒通組lvef、fs、sv顯著進步，lvesd、lvedd顯著縮短(p均0.05)，但各組間室壁厚度無顯著差異，見表1。表1細胞移植對心功能影響(s)注：各組治療后與對照組相比p0.05，s移值與安體舒通組相比p0.05。2.3血漿、組織羥脯胺酸及基質(zhì)金屬蛋白酶(p-9)含量測定結(jié)果對照組的血清、組織內(nèi)hyp含量高于其余兩組，細胞移植組最低，差異有顯著性(p0.050.01)，而細胞移植組的p-9含量顯著高于其余兩組(p0.05)，見表2。表2血漿、組織羥脯胺酸(hyp)含量比擬注：與對照

13、組比擬p0.05，p0.01;與安體舒通組比擬p0.05。2.4堵塞面積變化tt染色顯示對照組心肌堵塞壞死心肌包括心內(nèi)膜、心肌層、心外膜，表現(xiàn)為部分顏色蒼白，細胞移植組那么局限于心外膜或心外膜下(圖1)，分布范圍小于對照組。圖1tt(氯化四唑)染色評價堵塞面積3討論心肌堵塞后心肌缺血壞死，心肌間質(zhì)纖維結(jié)締增生，導(dǎo)致心室重塑，進一步引起心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴重并發(fā)癥。阻止或逆轉(zhuǎn)心室重塑的進展，將會延緩并發(fā)癥的發(fā)生，進步患者的生存率。因此通過干預(yù)心肌間質(zhì)纖維化，對于改善心室重塑具有積極意義。病理情況下，心肌部分既存在心肌膠原合成，同時也有心肌膠原降解過程，心肌間質(zhì)膠原保持合成與降解動態(tài)

14、變化。hyp是膠原纖維，尤其是心肌i型膠原主要成分之一，其含量占膠原纖維85%以上，代表著心肌膠原纖維合成，而p那么通過降解膠原纖維，抑制心肌纖維化。檢測細胞移植后hyp及p含量變化，可理解心肌間質(zhì)纖維化情況。與對照組相比，s組、安體舒通組血漿、心肌部分組織hyp低、p-9濃度高，說明兩組心肌膠原形成減少，尤其i型膠原纖維形成減少，而膠原降解強，對心室重塑效果好，s組更為明顯。其原因可能為：(1)s促進心肌再生和血管新生。研究證實s在心肌部分環(huán)境中可分化為心肌樣細胞及內(nèi)皮細胞，前者促進心肌再生，后者那么促進血管新生。tt染色顯示細胞移植組壞死心肌集中在心內(nèi)膜，而心內(nèi)膜、心肌層極少，而對照組壞死

15、心肌那么廣泛分布于心內(nèi)膜、心肌層、心外膜，細胞移植后心肌壞死區(qū)域和范圍減小，提示細胞移植促進心內(nèi)膜、心肌層心肌再生，從源頭上預(yù)防心肌膠原合成，因此心肌間質(zhì)hyp含量也降低1，2。p-9含量高，可能與s分化為內(nèi)皮細胞，促進血管新生，心肌部分缺血改善，心肌膠原分解增加有關(guān);(2)本研究前期研究說明，移植細胞表達心房利鈉肽，已證實其可使細胞內(nèi)環(huán)磷鳥苷(gp)濃度升高，刺激核絲氨酸-蘇氨酸激酶(akt)基因激活，后者可以抑制缺血心肌hyp表達35;(3)心肌缺血環(huán)境可促進體內(nèi)生物活性因子釋放，如轉(zhuǎn)化生長因子-1(tgf-1)，它是目前最有效的促纖維化細胞因子，可促進膠原和結(jié)締組織生長因子等細胞外基質(zhì)上

16、調(diào)和分泌增強，促進成纖維細胞增殖，增加膠原的生成。但在骨髓基質(zhì)細胞移植中，移植細胞局部分化內(nèi)皮細胞，一定程度上改善部分缺血環(huán)境，抑制了生物活性因子作用，減少心肌部分膠原的生成，故也是s組hyp含量最低原因之一6，7。與安體舒通組相比，s組羥hyp含量更低，可以更好抑制心肌膠原纖維合成，原因可能在于安體舒通僅抑制心肌部分血管緊張素ii、醛固酮介導(dǎo)的成纖維細胞增殖，其抗心肌纖維化作用程度有限，而s移植可從多個環(huán)節(jié)干預(yù)心肌膠原合成，同時促進p表達，增加心肌膠原降解?！緟⒖嘉墨I】1蔣雯，林國生，李庚生，等.兔骨髓間充質(zhì)干細胞自體移植對缺血心肌心功能的影響j.臨床心血管病雜志，2022，20(10):605-608.2張蕾，陳沅，田杰，等.骨髓間充質(zhì)干細胞心肌樣分化的微環(huán)境因素j.臨床心血管病雜志，2022，22(11)：686-688.3方志成，周昌娥，王瑋，等.5-氮胞苷對培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)細胞心房利鈉肽表達的影響j.心肺血管病雜志，2022，25(2)：118-121.4katt，uraskij，heny，etal.atr