骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)心肌梗塞心肌羥脯氨酸表達(dá)

1、骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)心肌堵塞心肌羥脯氨酸表達(dá)【摘要】目的：評(píng)價(jià)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)組織羥脯氨酸(hyp)含量的影響，討論細(xì)胞移植對(duì)心肌堵塞后心室重塑機(jī)制。方法：30只日本大耳白兔，隨機(jī)分為骨髓基質(zhì)細(xì)胞(s)組、安體舒通組、對(duì)照組。體外穿刺提取骨髓,別離、培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，s組、對(duì)照組心肌堵塞模型制作成功2周后沿堵塞周邊區(qū)域注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞懸液(3109/100l)或de培養(yǎng)基100l，安體舒通組模型制作成功后服用安體舒通20g。心臟超聲評(píng)價(jià)心功能，測(cè)定血漿、心肌組織hyp含量、基質(zhì)金屬蛋白酶(p-9)含量，以氯化四唑(tt)染色評(píng)價(jià)堵塞面積。結(jié)果：與對(duì)照組、安體舒通組相比，s組心功能進(jìn)步lvef:

2、(53.222.13)%(56.912.04)%(62.612.37)，p0.05;堵塞面積下降:(29.732.11)%(28.611.24)%(22.823.12)%，p0.05;血漿hyp含量(g/l)顯著下降(40.162.31)(34.241.98)(22.791.69)，p0.05;心肌組織hyp含量(g/g濕重)顯著下降(3.590.19)(2.670.81)(1.590.89)，p0.05;血基質(zhì)金屬蛋白酶含量(p-9，g/l)顯著增加(218.64115.23)(248.16103.9)(719.25312.2)，p0.05。結(jié)論：細(xì)胞移植可抑制組織羥脯氨酸合成，促進(jìn)基質(zhì)金屬

3、蛋白酶表達(dá)，增加心肌膠原降解，說(shuō)明干細(xì)胞移植可抑制心肌膠原合成、抑制心肌部分間質(zhì)纖維化，是細(xì)胞移植心功能改善機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】骨髓移植;心室重構(gòu);羥脯氨酸abstrat：bjetive:tassesstheeffetfarrstraelltransplantatinnnstitutinhydrxyprlinefyardialinfartininrabbit.ethds:islatedssfr30rabbitsbybnearrpuntureereulturedinellulture.elliplantednteeksaftertheleftanterirdesendingbranhasliga

4、ted.rabbitsasdividedintntrlgrup,antisternegrupandelliplantedgrup.the100lderellsuspensinasinjetedintthebrderareafyardialinfartin.theheartfuntinasassessedbyehardigraphybefreandafterelliplanted4eeks.theareafinfartinereestiatedbytt.thenstitutinhydrxyprlineandp-9ereestiated.results:paredithntrlgrupandant

5、isternegrup,ardiafuntinaeliratedlvef:(53.222.13)%vs.(56.912.04)%vs.(62.612.37)%，p0.05;theareafinfartin(29.732.11)%vs.(28.611.24)%vs.(22.823.12)%，p0.05;plasahydrxyprlineredued(40.162.31)vs.(34.241.98)vs.(22.791.69)，p0.05,andnstitutinhydrxyprlinealsredued(3.590.19)vs.(2.670.81)vs.(1.590.89)，p0.05;thep

6、-9inreased(218.64115.23)vs.(248.16103.9)vs.(719.25312.2)，p0.05insgrup.nlusin:theresultshthatesenhyalsteellstransplantatinanbviuslyaelirateardiafuntin,dereaseinfartinareaandyardiufibrsis.keyrds：bnearrtransplantatin;ventriularredeling;hydrxyprline心肌堵塞(i)后心肌間質(zhì)纖維化是心室重塑重要因素，更是堵塞后心衰、惡性心律失常等心血管事件發(fā)生的病理生理基矗傳

7、統(tǒng)藥物、介入手術(shù)對(duì)心室重塑療效有限。研究發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(arrstraalell，s)移植可改善心功能、心室重塑，其機(jī)制尚不明確。心肌羥脯氨酸(hydrxyprline,hyp)是心肌膠原合成標(biāo)志物之一。本研究觀察s移植對(duì)i后hyp表達(dá)的影響，討論細(xì)胞移植對(duì)i后心肌間質(zhì)纖維化的影響。1資料與方法1.1一般資料35月齡日本大耳白兔30只(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重22.5kg，雌雄不限，隨機(jī)分為對(duì)照組、安體舒通藥物治療組及細(xì)胞移植組。胎牛血清(hylne公司)，de培養(yǎng)基(hylne公司)，perll別離液(siga公司)，氯化四唑(2，3，5-triphenyltetrazliu

8、hlrid，tt，上海捷倍思基因技術(shù))。相差顯微鏡(lypusx170，日本)，彩色多普勒診斷儀(diasnisgateayfax，美國(guó))，北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)(hpias-1000)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成工程研究所，中國(guó))。1.2方法1.2.1兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(s)別離培養(yǎng)：見(jiàn)參考文獻(xiàn)1。1.2.2細(xì)胞移植：以10%烏拉坦經(jīng)耳緣作靜脈麻醉，結(jié)扎前降支，制作i模型。2周后，s組、對(duì)照組分別沿堵塞周邊區(qū)域隨機(jī)選取6個(gè)位點(diǎn)依次等量注射細(xì)胞懸液或de培養(yǎng)基100l(其中5107細(xì)胞/位點(diǎn))，每一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部分移植的細(xì)胞總數(shù)量3109。安體舒通組給予安體舒通20g，2次/d，服用1月。1.2.3心

9、功能、心室重塑評(píng)估:細(xì)胞移植前、后4周，彩色多普勒超聲檢查。測(cè)定左室收縮末期內(nèi)徑(lvesd)、左室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左室后壁厚度(lvph)，左室短軸縮短率(fs)，每搏輸出量(sv)，左室射血分?jǐn)?shù)(lvef)等。1.2.4堵塞面積評(píng)估：細(xì)胞移植后4周處死動(dòng)物，自左室心尖至心底每2連續(xù)切片5張，置入2%tt溶液，37溫箱染色30in。圖象分析儀計(jì)算堵塞區(qū)域在各層心肌中所占比例，重復(fù)3次，取平均值，即為堵塞面積。1.2.5血漿、組織羥脯氨酸含量測(cè)定：以樣本堿水解法測(cè)定血漿、組織hyp含量。分別于耳緣靜脈取血0.5l及堵塞區(qū)域取3小塊左室堵塞心肌組織檢測(cè)血漿、組織hyp含量，測(cè)定濕重3

10、0100g，置入玻璃試管，加1l水解液，混勻，95水解20in，流水冷卻加指示劑1滴，依次參加調(diào)ph甲乙液，使ph值維持在66.8，取34l稀釋水解液加適量活性炭，混勻，3500r/in，離心10in，取上清液1l，依次參加hyp試劑1，2，3各0.5l，并混勻靜置5in，60水浴15in，冷卻后，3500轉(zhuǎn)/in，離心10in，取上清液在550n處，1光徑，蒸餾調(diào)零，測(cè)定空白管及標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管吸光度。組織hyp含量(g/g濕重)=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)管含量(5g/l)水解液總體積(10l)/組織濕重(g);血漿hyp含量(g/l)=(測(cè)定管吸光度

11、-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)管含量(5g/l)水解液總體積(l)/取樣量(l)。1.2.6基質(zhì)金屬蛋白酶(p-9)檢測(cè)：采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)，試劑盒(huenp-9kit1quantikine)為美國(guó)rdsyste公司提供，質(zhì)量濃度單位為g/l，靈敏度為0.156g/l。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由spss10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，采用單因素方差分析、q檢驗(yàn)，p0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1細(xì)胞培養(yǎng)剛接種的細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液。第34d可見(jiàn)少量單個(gè)核細(xì)胞貼壁，呈梭形或索條形，分布不均，612d貼壁細(xì)胞逐漸增多，部分呈巢狀生長(zhǎng)，形

12、成多個(gè)成纖維樣細(xì)胞集落，1620d細(xì)胞逐漸聚集成片可以傳代。2.2心臟超聲結(jié)果評(píng)價(jià)與對(duì)照組相比，s組、安體舒通組lvef、fs、sv顯著進(jìn)步，lvesd、lvedd顯著縮短(p均0.05)，但各組間室壁厚度無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。表1細(xì)胞移植對(duì)心功能影響(s)注：各組治療后與對(duì)照組相比p0.05，s移值與安體舒通組相比p0.05。2.3血漿、組織羥脯胺酸及基質(zhì)金屬蛋白酶(p-9)含量測(cè)定結(jié)果對(duì)照組的血清、組織內(nèi)hyp含量高于其余兩組，細(xì)胞移植組最低，差異有顯著性(p0.050.01)，而細(xì)胞移植組的p-9含量顯著高于其余兩組(p0.05)，見(jiàn)表2。表2血漿、組織羥脯胺酸(hyp)含量比擬注：與對(duì)照

13、組比擬p0.05，p0.01;與安體舒通組比擬p0.05。2.4堵塞面積變化tt染色顯示對(duì)照組心肌堵塞壞死心肌包括心內(nèi)膜、心肌層、心外膜，表現(xiàn)為部分顏色蒼白，細(xì)胞移植組那么局限于心外膜或心外膜下(圖1)，分布范圍小于對(duì)照組。圖1tt(氯化四唑)染色評(píng)價(jià)堵塞面積3討論心肌堵塞后心肌缺血壞死，心肌間質(zhì)纖維結(jié)締增生，導(dǎo)致心室重塑，進(jìn)一步引起心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥。阻止或逆轉(zhuǎn)心室重塑的進(jìn)展，將會(huì)延緩并發(fā)癥的發(fā)生，進(jìn)步患者的生存率。因此通過(guò)干預(yù)心肌間質(zhì)纖維化，對(duì)于改善心室重塑具有積極意義。病理情況下，心肌部分既存在心肌膠原合成，同時(shí)也有心肌膠原降解過(guò)程，心肌間質(zhì)膠原保持合成與降解動(dòng)態(tài)

14、變化。hyp是膠原纖維，尤其是心肌i型膠原主要成分之一，其含量占膠原纖維85%以上，代表著心肌膠原纖維合成，而p那么通過(guò)降解膠原纖維，抑制心肌纖維化。檢測(cè)細(xì)胞移植后hyp及p含量變化，可理解心肌間質(zhì)纖維化情況。與對(duì)照組相比，s組、安體舒通組血漿、心肌部分組織hyp低、p-9濃度高，說(shuō)明兩組心肌膠原形成減少，尤其i型膠原纖維形成減少，而膠原降解強(qiáng)，對(duì)心室重塑效果好，s組更為明顯。其原因可能為：(1)s促進(jìn)心肌再生和血管新生。研究證實(shí)s在心肌部分環(huán)境中可分化為心肌樣細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，前者促進(jìn)心肌再生，后者那么促進(jìn)血管新生。tt染色顯示細(xì)胞移植組壞死心肌集中在心內(nèi)膜，而心內(nèi)膜、心肌層極少，而對(duì)照組壞死

15、心肌那么廣泛分布于心內(nèi)膜、心肌層、心外膜，細(xì)胞移植后心肌壞死區(qū)域和范圍減小，提示細(xì)胞移植促進(jìn)心內(nèi)膜、心肌層心肌再生，從源頭上預(yù)防心肌膠原合成，因此心肌間質(zhì)hyp含量也降低1，2。p-9含量高，可能與s分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生，心肌部分缺血改善，心肌膠原分解增加有關(guān);(2)本研究前期研究說(shuō)明，移植細(xì)胞表達(dá)心房利鈉肽，已證實(shí)其可使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷鳥(niǎo)苷(gp)濃度升高，刺激核絲氨酸-蘇氨酸激酶(akt)基因激活，后者可以抑制缺血心肌hyp表達(dá)35;(3)心肌缺血環(huán)境可促進(jìn)體內(nèi)生物活性因子釋放，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(tgf-1)，它是目前最有效的促纖維化細(xì)胞因子，可促進(jìn)膠原和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等細(xì)胞外基質(zhì)上

16、調(diào)和分泌增強(qiáng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，增加膠原的生成。但在骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植中，移植細(xì)胞局部分化內(nèi)皮細(xì)胞，一定程度上改善部分缺血環(huán)境，抑制了生物活性因子作用，減少心肌部分膠原的生成，故也是s組hyp含量最低原因之一6，7。與安體舒通組相比，s組羥hyp含量更低，可以更好抑制心肌膠原纖維合成，原因可能在于安體舒通僅抑制心肌部分血管緊張素ii、醛固酮介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，其抗心肌纖維化作用程度有限，而s移植可從多個(gè)環(huán)節(jié)干預(yù)心肌膠原合成，同時(shí)促進(jìn)p表達(dá)，增加心肌膠原降解?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1蔣雯，林國(guó)生，李庚生，等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植對(duì)缺血心肌心功能的影響j.臨床心血管病雜志，2022，20(10):605-608.2張蕾，陳沅，田杰，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌樣分化的微環(huán)境因素j.臨床心血管病雜志，2022，22(11)：686-688.3方志成，周昌娥，王瑋，等.5-氮胞苷對(duì)培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞心房利鈉肽表達(dá)的影響j.心肺血管病雜志，2022，25(2)：118-121.4katt，uraskij，heny，etal.atr