CCK8對LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCs CuZnSOD基因表達影響的受體機制

1、CCK-8對LPS誘導(dǎo)大鼠TASMCs CuZn-SOD基因表達影響的受體機制【摘要】目的討論八肽膽囊收縮素(K-8)對體外脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠胸主動脈平滑肌細胞(TASs)uZn-SD基因表達影響的受體機制。方法用貼塊法培養(yǎng)大鼠TASs，經(jīng)K-8、LPS、R-1409、R-2945、K+LPS、R-1409+LPS、R-2945+LPS、R-1409+K-8+LPS、R-2945+K-8+LPS及溶劑單獨或共同孵育細胞，用RT-PR技術(shù)檢測uZn-SDRNA表達。結(jié)果對照組TASsuZn-SDRNA低程度表達，LPS誘導(dǎo)TASsuZn-SDRNA表達上調(diào)(P0.05)，K-8預(yù)處理后，L

2、PS對TASsuZn-SDRNA表達的誘導(dǎo)作用可局部受抑，預(yù)先用R-1409110-5l/L、R-2945110-5l/L處理后，再分別參加LPS和K-8，R-1409+K-8+LPS、R-2945+K-8+LPS兩組uZn-SDRNA表達均高于K-8+LPS組P0.01，但仍低于LPS組(P0.05)，其中R-2945的拮抗作用比R-1409稍明顯;R-1409、2945單獨作用與對照組相比差異無顯著性(P0.05)。結(jié)論K-8通過其受體下調(diào)LPS對TASsuZn-SD基因表達的誘導(dǎo)作用，其中K-BR較K-AR作用稍大。【關(guān)鍵詞】八肽膽囊收縮素；脂多糖；血管平滑肌細胞；K受體；銅-鋅超氧化物

3、歧化酶Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetfK-8reeptrnLPS-indueduZn-SDRNAexpressininratTASs.ethdsRatthraiartasthusleells(TASs)frtheattahent-blkultureereinubatedithNS,LPS(0.1g/L),K-8(110-8l/L),R-1409(110-5l/L,thespeifiantagnistfK-AR)andR-2945(110-5l/L,thespeifiantagnistfK-BR),respetivelyrinbinatin.Theexpr

4、essinsfuZn-SDRNAereassayedbyRT-PR.ResultsTheexpressinsfLPS-indueduZn-SDRNAereup-regulated,parediththentrlgrup(P0.05).SubsequenttK-8pretreatent,theindutinfLPSttheexpressinsfuZn-SDRNAinTASsaspartiallyinhibited.FllingpretreatentithR-1409(110-5l/L)andR-2945(110-5l/L),LPSandK-8ererespetivelyadded.Theexpr

5、essinsinR-1409+K-8+LPSandR-2945+K-8+LPSgrupserehigherthanK-8+LPSgrup(P0.01),buterestilllerthanthsefLPSgrup(P0.05).TheantagnisteffetfR-2945asslightlyreevidentthanthatfR-1409,hileEitherR-1409rR-2945alnehadnsignifiantdifferenesinparisniththentrlgrup(P0.05).nlusinK-8andn-regulateLPS-indueduZn-SDRNAexpre

6、ssininTASsbyeansfitsreeptrsK-ARandK-BR,fhihK-BRhadslightlygreaterindutinthanK-AR.Keyrds:hleystkinintapeptide;lipply-saharides;thraiartasthusleells;hleystkininreeptr;u-Znsuperxidedisutase內(nèi)毒素休克是嚴重危害人類安康的病理過程，死亡率極高。血管調(diào)節(jié)機制紊亂是內(nèi)毒素休克特征性病理改變之一，主要表現(xiàn)為內(nèi)毒素休克發(fā)生早期主動脈壓下降、肺動脈壓升高。在內(nèi)毒素休克的發(fā)病過程中氧自由基xygen-derivedfreerad

7、ials，F(xiàn)R的生成增多與血管調(diào)節(jié)機制紊亂親密相關(guān)1。八肽膽囊收縮素hleystkinintapeptide，K-8是一種小分子腦腸肽，通過其受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體，根據(jù)親和力以及生物學(xué)功能的不同，分為A、B兩種亞型，其特異性阻斷劑可拮抗K-8的作用2。K-8具有明確的抗內(nèi)毒素休克作用，可明顯降低內(nèi)毒素休克大鼠的死亡率，本實驗室已有研究3說明，體外脂多糖(LPS)可引起培養(yǎng)的血管平滑肌細胞總超氧化物歧化酶SD活性降低，誘導(dǎo)uZn-SD、n-SDRNA表達上調(diào)，而K-8可呈劑量依賴性抑制這一作用，翻轉(zhuǎn)導(dǎo)致的SD活性降低4。本實驗利用原代大鼠胸主動脈平滑肌細胞(thraiart

8、isthusleells，TASs)，在以往研究根底上觀察K-8對LPS誘導(dǎo)TASsuZn-SD基因表達的受體機制，進一步研究K-8緩解內(nèi)毒素休克血管動力學(xué)紊亂的分子機制。1材料和方法1.1材料大腸桿菌脂多糖(EliLPS)、硫酸化K-8及胰蛋白酶(Siga公司)；DE培養(yǎng)基(Gib公司)；RT-AV(TAKARA公司)；Trizl(北京賽百勝)；胎牛血清(北京元亨圣馬公司)；-175型2培養(yǎng)箱(日本三洋株式會社)；其余試劑均系國產(chǎn)分析純。雄性、安康無熱原ister大鼠55只，(12020)g，由河北省實驗動物中心提供。1.2方法1.2.1大鼠TASs的別離、培養(yǎng)和預(yù)處理用貼塊干涸法培養(yǎng)大鼠T

9、ASs。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉45g/kg麻醉后，于無菌條件下迅速取出胸主動脈，放入無血清的DE培養(yǎng)液中，仔細剝?nèi)ネ饽ぃv行剖開血管，輕輕刮去內(nèi)皮細胞，以無血清的培養(yǎng)液洗23次，剪碎成11大小,移入培養(yǎng)瓶中，均勻種植于瓶底壁,參加含200l/L胎牛血清、1105U/L青霉素及100g/L鏈霉素的DE培養(yǎng)基，瓶底朝上置于2培養(yǎng)箱中，待組織塊邊緣干涸后(約3.5h)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊完全浸泡于培養(yǎng)液中，靜止5天，觀察后換液。細胞鋪滿瓶底80%以上時，參加2.5g/L胰蛋白酶消化，12分裝傳代。實驗用58代細胞。1.2.2實驗分組K-8組、LPS組、R-1409組、R-2945組、K+LPS組、R-

10、1409+LPS組、R-2945+LPS組、R-1409+K-8+LPS組、R-2945+K-8+LPS組及對照組。各組分別參加相應(yīng)成分，其中LPS為0.1g/L，K-8為110-8l/L,R-1409和2945均為110-5l/L，對照組加等體積的生理鹽水,繼續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)時間后搜集細胞。實驗獨立重復(fù)3次。1.2.3半定量RT-PR檢測SDRNA表達TASs預(yù)處理4h,Trizl一步法提取細胞總RNA，嚴格按說明書進展操作，實驗所用金屬器械及玻璃器皿均經(jīng)過180，6h干烤，移液器頭及EP管均經(jīng)過DEP水處理。取上述總RNA提取液各1l行純度與完好性的鑒定，取總RNA11l(5.5g)，在AV逆

11、轉(zhuǎn)錄酶作用下，用隨機引物合成DNA。根據(jù)GenBank中SDDNA序列(uZn-SD：Z21917)，用引物設(shè)計軟件Prier5.0設(shè)計特異性引物。uZn-SD上游引物：5-AGGATTTGTTT-3，下游引物：5-AGGATAAATA-3(276bp)；內(nèi)參對照-atin上游引物：5-GAGGGAAATGTGGTGA-3，下游引物：5-TGGAAGGTGGAAGTGAG-3(450bp)。在含有15l/Lgl2,1UTaqDNA聚合酶及20pl/LSD特異性引物的25l反響體系中,進展DNA的聚合酶鏈反響(PR)。PR循環(huán)參數(shù)為:預(yù)變性943in；變性9445s；復(fù)性5445s(-atin)

12、，5045s(u-ZnSD)；延伸7245s，進展30次循環(huán)后進一步延伸725in。取15l合成的PR反響產(chǎn)物經(jīng)18g/L瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳100V穩(wěn)壓50in，紫外燈下觀察結(jié)果、拍照，并掃描至計算機中。用江蘇捷達凝膠分析軟件對電泳譜帶進展半定量分析，uZnSD與-atin的光密度比值代表RNA相對表達程度(圖1)。1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進展統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用s表示，組間比擬行單因素方差分析(ne-ayANVA)，有顯著差異者進一步用最小顯著性極差法檢驗進展兩兩比擬。檢驗水準(zhǔn)：=0.05。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1K-8、R-1409及R-2945對LP

13、S誘導(dǎo)的uZn-SDRNA表達的影響對照組TASs存在著uZn-SDRNA根底表達；參加LPS處理4h，uZn-SDRNA表達明顯上調(diào)，與對照組相比差異有顯著性(P0.01)；預(yù)先30in參加K-8，那么LPS誘導(dǎo)的uZn-SDRNA表達上調(diào)可局部抑制，與LPS組相比有顯著差異P0.01；而預(yù)先10in分別給于R-1409及R-2945，那么局部受抑的uZn-SDRNA表達均上調(diào)，與LPS+K-8組相比差異有顯著性P0.01，且R-2945的上調(diào)幅度略高于R-1409；單獨參加K-8，SDRNA表達下降，與對照組相比有顯著差異P0.05；單獨參加R-1409、R-2945，與對照組相比差異不明

14、顯圖2。圖1R-1409、R-2945在K-8抑制LPS誘導(dǎo)胸主動脈平滑肌細胞uZn-SDRNA表達中的作用略圖2R-1409、R-2945在K-8抑制LPS誘導(dǎo)胸主動脈平滑肌細胞uZn-SDRNA表達中的作用略與對照組比擬：aP0.05,aaP0.01;與LPS組比擬：bP0.05,bbP0.01;與LPSK-8組比擬：P0.013討論K-8作為一種小分子腦腸肽，參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)功能活動，通過與靶細胞膜上的受體結(jié)合發(fā)揮作用5，其受體主要分為2種亞型：K-A受體K-AR及K-B胃泌素受體K-BR。研究說明，K-8具有明確的抗內(nèi)毒素休克作用，可使內(nèi)毒素休克大鼠的血壓升高，反

15、轉(zhuǎn)肺動脈血壓增高6-7。內(nèi)毒素休克發(fā)病過程中活性氧(RS)生成增多,增多的RS是導(dǎo)致血管功能紊亂的重要環(huán)節(jié)之一，以往實驗說明，K-8在一定階段可以逆轉(zhuǎn)LPS引起SD活性降低、發(fā)揮抗氧化效應(yīng)，這可能是其緩解抗內(nèi)毒素休克的重要作用處徑之一。人體內(nèi)主要存在uZn-SD、n-SD和細胞外液SD(E-SD)，但以uZn-SD為主，其含量最高，是人體細胞抵御氧自由基FR損害的重要酶。我們研究發(fā)現(xiàn)，LPS可誘導(dǎo)TASsuZn-SD基因表達增加；K-8下調(diào)LPS對TASsuZn-SD基因表達的誘導(dǎo)作用。推測其機制，可能是LPS引起體內(nèi)FR增多，過量的FR導(dǎo)致uZn-SD滅活，在細胞內(nèi)在代償調(diào)節(jié)機制作用下，uZ

16、n-SDRNA表達增高，K-8可以抑制這一作用。我們已經(jīng)證實，NF-B在這一作用中起信號介導(dǎo)作用4，使用K-R非特異性拮抗劑丙谷胺及K-AR/BR的特異性阻斷劑R-1409/2945均可拮抗K-8的抗內(nèi)毒素休克作用8-10，提示K-8通過其受體發(fā)揮抗休克作用。K-8本實驗以TASs為靶細胞，進一步討論了K-8效應(yīng)的分子機制。結(jié)果顯示，K-8可局部下調(diào)LPS誘導(dǎo)大鼠TASsuZn-SD基因的表達。預(yù)先用R-1409、R-2945處理TASs10in后，再分別參加LPS和K-8。觀察到R-1409+K-8+LPS、R-2945+K-8+LPS兩組uZn-SDRNA表達均高于K-8+LPS組P0.01，但仍低于LPS組P0.05，提示R-1409和R-2945均局部阻斷了K-8與其受體的結(jié)合，局部逆轉(zhuǎn)了K-8對LPS的抑制效應(yīng)。預(yù)先給予110-5l/LR-1409后，uZn-SD基因表達量與K-8+LPS組相比升高了103.1%P0.01；預(yù)先給予110-5l/LR-2945處理后，u