下載本文檔
版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、內(nèi)毒素的去除是做蛋白表達時至關重要的一步,同時也是非常棘手的問題,本文就針對內(nèi)毒素的去除方法以及各方法的注意事項進行了歸納總結(jié)。、什么是內(nèi)毒素?內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的脂多糖。內(nèi)毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后才釋放出來,所以叫做內(nèi)毒素。所有能引起熱原反應的物質(zhì)稱為熱原。藥品中的熱原主要是細菌內(nèi)毒素。一般可以認為:細菌內(nèi)毒素是熱原,但熱原不等于細菌內(nèi)毒素。二、細菌內(nèi)毒素的理化性質(zhì)耐熱性:徹底滅活需250C高溫干烤一小時水溶性:可溶于水,生產(chǎn)中可用無熱原水沖洗以除去熱原。不揮發(fā)性被吸附性:可被活性碳吸附被酸堿破壞:0.1MHCI或0.1MNaOH浸泡4小時被氧化劑破壞:30
2、%雙氧水浸泡4小時,可完全破壞三、器皿中內(nèi)毒素的去除:干熱法適用對象:耐熱物品如玻璃制品、金屬制品等生產(chǎn)過程中所用的容器處理方法180C34h或250C30min2h注意事項:1在干烤前,被加熱的玻璃器皿上最好不要有水珠,否則可能會使玻璃器皿損壞。2烘烤結(jié)束后,玻璃器皿不要馬上從電熱烘箱中拿出,要等溫度適度降低之后才可以拿出,以免因溫差太大而造成玻璃器皿損壞。3器皿上不能含有紙質(zhì)或塑料制品,以免烘烤時燃燒或熔化?;瘜W降解法適用對象:主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的內(nèi)毒素。處理方法:常用35%雙氧水、重鉻酸鉀硫酸清潔液(重鉻酸鉀:硫酸:水常用配比1:1:10或1:2:8)、0.1M
3、HCI或0.1MNaOH浸泡去除。一般處理4h以上。注意事項:佩戴防護用具,防止皮膚直接接觸。四、溶液中內(nèi)毒素的去除方法原理優(yōu)點缺點液相分離法一些去污劑,如TritonX-114,脫氧膽酸鈉能夠和內(nèi)毒素的脂質(zhì)部分結(jié)合,通過液相分離的方法萃取內(nèi)毒素從而使后者有效地去除。對內(nèi)毒素的去除率高,且不影響有效成份的活性。該法簡單高效、價格低廉、適合大規(guī)模應用,在我們?nèi)粘5牡鞍准兓休^為常用。去內(nèi)毒素后的樣品會有微量去污劑的殘留。分子篩法分子篩是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構,根據(jù)分子大小進行分離的一種方法。由于蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的分子量有較大差別,因此利用分子篩可以有效去除內(nèi)毒素。去除效果明顯每次處理量小,處理時間較長
4、。離子交換色譜法當溶液PH2時,內(nèi)毒素帶有負電荷。因此內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAESepharoseFastFlow有較強結(jié)合。柱上的內(nèi)毒素可在洗脫目標蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。成本低,吸附容量大但不適合于溶液中存在其它帶負電荷物質(zhì)的情況。親和色譜法將適當?shù)呐浠梯d于色譜基質(zhì)上合成出親和介質(zhì),使它特異性結(jié)合內(nèi)毒素。GenScript將多粘菌素B(PMB)偶聯(lián)于SepharoseFF上,以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素。高效能、高選擇性相對成本較咼。超濾法由于內(nèi)毒素具有較大的相對分子質(zhì)量,因此可選用超濾膜去除溶液中的內(nèi)毒素。操作簡單,處理量大操作過程中的壓力較高。不適合含有較大相對分子質(zhì)量
5、成份的樣品。因為在除去熱原的同時會阻留或吸附樣品中的有效成份,使產(chǎn)品收率大受影響。吸附法活性炭用于去除內(nèi)毒素是由于內(nèi)毒素的相對分子質(zhì)量較大。適合于組分較為簡單的小分子的溶液中或水中去除內(nèi)毒素?;钚蕴砍S昧繛?.1%0.5%。成本低,處理量大?;钚蕴康倪x擇性較差,易吸附有效成份,純化后溶液中的殘余活性炭不易去除,且自身可能含有的重金屬造成樣品污染,因此目前很少使用蒸餾法此方法可用于生產(chǎn)去熱源水,作為注射用水或洗滌水。去除效果明顯成本較高疏水層析法內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強的疏水性,但在高鹽下會凝集,無法掛上疏水層析柱。因此可選擇能結(jié)合目標蛋白的疏水介質(zhì)去除內(nèi)毒素適用于高鹽濃度的樣品目前技術不夠成熟
6、,還需要進一步探索但是,各種去內(nèi)毒素的方法不是孤立的,可以相互結(jié)合使用。比如,如果液相分離法得到的蛋白內(nèi)毒素水平未達標,可以接著利用分子篩法進一步去除內(nèi)毒素。五、作為目前去內(nèi)毒素常用的方法,液相分離法的注意事項值得我們重視1液相分離方法應用于蛋白純化中內(nèi)毒素的去除目的蛋白上樣后,用預冷的基礎溶液+1%TritonX-114緩慢淋洗柱子,直至A280數(shù)值穩(wěn)定不變;b用預冷的去內(nèi)毒素基礎溶液淋洗柱子,直至A280數(shù)值達到基線,穩(wěn)定不變;用各梯度去內(nèi)毒素的洗脫液洗脫,收集各洗脫液于去內(nèi)毒素的收集管中。d此方法適用廣泛,如我們常用Ni柱GST柱和離子交換柱等純化。e.純化過程應盡量在潔凈的環(huán)境下進行,
7、純化時間不宜過長。f所用的吸管、槍頭等器材應為經(jīng)去內(nèi)毒素處理的。2.液相分離法應用于大量樣品中內(nèi)毒素的去除a在大量蛋白樣品中加入終濃度為1%的TritonXT14,充分混勻,冰浴5min,使之成為一相;b升溫超過其濁點21C,37C孵育,觀察分層情況;待溶液中出現(xiàn)明顯分層后,室溫下12000r/min,離心5min,吸取上清液;為達到較好的去除效果,可以重復2次。如果樣品內(nèi)毒素含量較高,可以提高TritonXT14濃度至2%。f如果升溫至37C后,分層不明顯或比較慢,可以升溫至56C孵育。g.本方法不適用于去除膜蛋白中的內(nèi)毒素六、去內(nèi)毒素試劑的配置在溶解前將固體試劑用180C烘4-5h,以去除試劑中的水分和內(nèi)毒素。此法適用于試劑的熔點高于180C。若試劑熔點低于180C,常使用80C烘過夜。去內(nèi)毒素的水溶解烘過的試劑,定容,調(diào)節(jié)pH。檢測所配置試劑的內(nèi)毒素含量是否達標,通常為0.01EU/ml。常見的熔點低于180C或高溫分解的試劑:1.Tris(168-172C)2.尿素(
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- Α-烯基磺酸鹽(AOS9235)行業(yè)商業(yè)計劃書
- 7 敬業(yè)與樂業(yè)2024-2025學年九年級上冊語文同步配套教學設計(五四制)
- 湖北省襄陽市第四十七中學八年級信息技術下冊《第二單元 活動2 編輯視頻短片》教案
- 《跨境可信數(shù)據(jù)運維管理規(guī)范》編制說明
- 二建法規(guī)-思維導圖-王欣
- (廣東專用)高考歷史大一輪復習 第30講 近代中國的思想解放潮流(含解析)新人教
- 你的呼吸(教學設計)-2023-2024學年二年級下冊科學滬教版
- 2025年湖南省長沙市瀏陽市高三綜合能力測試(二)生物試題含解析
- 2025年湖北黃岡中學高三1月調(diào)研(期末)測試生物試題含解析
- 2025年河南省三門峽市重點中學高三下學期開學收心考試(3月)生物試題含解析
- AQ 1083-2011 煤礦建設安全規(guī)范 (正式版)
- DZ∕T 0148-2014 水文水井地質(zhì)鉆探規(guī)程(正式版)
- 第四章-國防動員
- 你好,無廢校園主題班會
- 部門KPI指標建立與分解詳細解析.ppt
- 人機工程學案例分析
- 電梯主要部件介紹(經(jīng)典實用)
- 外貿(mào)流程詳解(附流程圖)
- 灰土墊層施工方案(完整版)
- 便利店門店培訓資料
- 飛行員個人簡歷表
評論
0/150
提交評論