hiv核酸檢測技術及應用

1、hiv核酸檢測技術及應用hiv核酸檢測技術及應用第1頁目 錄HIV核酸介紹HIV核酸檢測意義HIV核酸檢測技術現(xiàn)實狀況與發(fā)展HIV核酸檢測質量控制HIV核酸檢測流程（新規(guī)范）HIV核酸檢測實例應用hiv核酸檢測技術及應用第2頁HIV病毒 病毒顆粒：呈球形，直徑100-120nm 病毒衣殼：呈20面體立體對稱 病毒關鍵：由RNA（兩條ssRNA）、核衣殼蛋白、逆轉錄酶、核糖核酸酶及整合酶所組成hiv核酸檢測技術及應用第3頁HIV RNAHIV生活周期圖HIV前病毒DNAhiv核酸檢測技術及應用第4頁HIV感染自然史急性感染期無癥狀期艾滋病期hiv核酸檢測技術及應用第5頁HIV感染后標志物改變時間

2、HIVRNAp24AgIgMAnti-HIVIgGAnti-HIVReactivity012345678Weeks post-infectionhiv核酸檢測技術及應用第6頁HIV核酸檢測意義HIV核酸縮短窗口期指導治療自然史艾滋病“元兇”病程耐藥性hiv核酸檢測技術及應用第7頁HIV核酸檢測意義HIV-1感染診療嬰兒感染早期診療（小于18月齡）HIV-1感染補充試驗及急性期和晚期感染者診療治療效果監(jiān)測 通常在治療一個月后病毒載量降低0.5log以上才被認為臨床治療有效，六個月后應降到小于檢測限病程監(jiān)控及預測耐藥性監(jiān)測hiv核酸檢測技術及應用第8頁HIV核酸檢測技術分為HIV定性和HIV定量檢

3、測兩大類：HIV定性檢測：HIV核酸（RNA和前病毒DNA）檢測HIV定量檢測：又稱HIV病毒載量檢測（Viral load），主要用于抗病毒治療患者療效評價，也可用于補充試驗（新規(guī)范）hiv核酸檢測技術及應用第9頁HIV核酸定性檢測IN-HOUSE（文件報道）Roche Amplicor HIV-1 DNA PCR, v1.5試劑盒(已停產(chǎn))Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test,v2.0雅培RealTime HIV-1定性檢測試劑盒HIV病毒儲存庫檢測技術（超敏PCR）hiv核酸檢測技術及應用第10頁In-hous

4、e普通PCR診療方法核酸提取PCR或RT-PCR擴增電泳判定或測序hiv核酸檢測技術及應用第11頁HIV-1基因組結構結構蛋白酶類衣殼蛋白9.2kbhiv核酸檢測技術及應用第12頁 檢測設計：分別針對HIV gag、env和pol三個獨立PCR檢測體系，并另外設置1個檢測內(nèi)參（-actin）檢測體系（國家艾滋病參比試驗室）陽性：擴增出人-actin，HIV-1 gag 、env和pol基因中擴增出2個及以上基因片段陰性：擴增出人球蛋白基因，HIV-1 gag 、env和pol 3個基因都沒有擴增出來不確定：人球蛋白基因未擴增出預期片段或HIV-1 gag 、env和pol 3個基因只擴增出一個

5、In-house普通PCR診療方法hiv核酸檢測技術及應用第13頁“套式”PCRAAAAAA53gag pol envReverse primer 1Forward primer 1第一輪PCR 產(chǎn)物Reverse primer 2Forward primer 2第二輪PCR 產(chǎn)物優(yōu)點: 增加敏感性/特異性缺點: 增加擴增偏差機會 需要增加操作過程 輕易增加污染機會hiv核酸檢測技術及應用第14頁瓊脂糖凝膠電泳-actingagenvpolhiv核酸檢測技術及應用第15頁In-house 熒光PCR 我國外文件報道以HIV RNA或前病毒DNA作為檢測目標，選擇LTR、gag、pol等基因作為

6、靶基因，建立熒光PCR檢測方法HIV核酸陰性HIV核酸陽性hiv核酸檢測技術及應用第16頁羅氏HIV-1 Qual Test 基于COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 48平臺，用于HIV-1 RNA和前病毒DNA定性診療，檢測樣本類型包含抗凝全血、血漿、血清、干血斑或干漿斑等hiv核酸檢測技術及應用第17頁The COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0Dual-PCR target Assay designgag:Targeted in previous Roche HIV-1 tests L

7、arge sequence database from Roches Global surveillance programNot a drug target todayLTR:Targeted in Roche MPx blood screening testNot a drug target today檢測總核酸（DNA/RNA）hiv核酸檢測技術及應用第18頁檢測結果示例陰性陽性hiv核酸檢測技術及應用第19頁HIV核酸定量檢測HIV病毒載量(Viral Load)指體內(nèi)復制病毒數(shù)量，反應體液（普通是血漿）中HIV病毒含量1987年John首次提出病毒載量（viral load）概念，體

8、內(nèi)復制病毒數(shù)量是不能直接測量，普通用血漿中HIV RNA拷貝數(shù)代表HIV病毒載量。 是HIV核酸定量檢測，普通以血漿HIV RNA拷貝數(shù)/ml表示hiv核酸檢測技術及應用第20頁常見HIV病毒載量檢測方法主要核酸擴增和信號放大擴增兩種方法NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃)Cobas Amplicor/Taqman (Roche，羅氏)m(Abbott，雅培)bDNA/Versant 440 (西門子)我國：凱杰（匹基），科華，達安、東北制藥、萬泰 麗珠、科華等hiv核酸檢測技術及應用第21頁NucliSENS EasyQ血漿樣本miniMAGeasyMAG病毒載量分

9、析儀hiv核酸檢測技術及應用第22頁引物 2NASBA擴增技術（nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依賴性擴增法）逆轉錄酶逆轉錄酶T7 RNA聚合酶逆相 RNA 擴增物RNase H引物 1引物1 延伸 RNase H 和引物 2延伸 RNAT7 RNA 聚合酶逆轉錄酶逆轉錄酶“分子信標” 雜交AMV-RT (鳥肉瘤病毒逆轉錄酶):延伸形成RNA-DNA 雜交鏈 RNase H:降解雜交鏈中RNAT7-RNA聚合:轉錄形成RNA轉錄產(chǎn)物T7開啟子序列hiv核酸檢測技術及應用第23頁COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMa

10、n48COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48 系統(tǒng)hiv核酸檢測技術及應用第24頁完整探針: 匯報基團 (R) 熒光被淬滅基團(Q)抑制h引物引物RQ探針被5-外切核酸酶切掉QR匯報基團熒光發(fā)射hQRR = 匯報基團 Q = 淬滅基團 TaqMan水解探針技術hiv核酸檢測技術及應用第25頁雅培HIV-1病毒載量儀m全自動實時熒光定量PCR系統(tǒng)HIV-1病毒載量自動化檢測平臺（96通量）已認證用于干血斑病毒載量檢測嬰兒HIV-1核酸檢測試劑盒用于試驗室in-house方法自動化核酸提取此平臺同時有HBV病毒載量，HCV病毒載量及分型，HPV高危分型，MTB檢測，CT/

11、NG檢測等試劑盒hiv核酸檢測技術及應用第26頁bDNA (Bayer versantTM)核酸信號放大！而非核酸分子擴增！hiv核酸檢測技術及應用第27頁人工加樣試劑分裝自動化提取人工配液PCR儀檢測臨床式半自動使用方案北京萬泰生物藥業(yè)股份有限企業(yè)hiv核酸檢測技術及應用第28頁PCR儀結果導入WanTag 全自動核酸提取儀PCR檢測HIV核酸定量檢測試劑-全自動化平臺強強聯(lián)合整合Tecan加樣與Thermo核酸提取平臺高通量 同時可用，實現(xiàn)1h內(nèi)96份樣本提取 高自動化可自動完成包含加樣、核酸提取與純化、PCR試劑配制與分配等擴增前全部操作采磁棒轉移技術，有效防止氣溶膠污染漢字自主操作界面

12、，方便快捷hiv核酸檢測技術及應用第29頁達安基因HIV病毒載量核酸檢測系統(tǒng)HIV-1核酸定量檢測試劑盒全自動核酸提取儀DA3200國產(chǎn)化！全自動！hiv核酸檢測技術及應用第30頁PANTHER系統(tǒng)TMA（轉錄介導等溫擴增）簡易工作流程：“上樣”直接到“結果”，3.5小時得到第一個樣本結果，每分鐘一個結果，12個小時500個樣本hiv核酸檢測技術及應用第31頁核酸檢測在新版規(guī)范主要內(nèi)容新增補充試驗概念，補充試驗包含抗體確證試驗和核酸試驗（定性和定量試驗）新增核酸檢測流程，對復檢結果有反應情況，增加了能夠選擇核酸診療策略；對于HIV抗體確證結果不確定和疑似急性期感染樣品提議采取HIV-1 核酸試

13、驗。修改了艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV感染早期感染檢測流程hiv核酸檢測技術及應用第32頁補充試驗（核酸試驗） 初篩+復檢+hiv核酸檢測技術及應用第33頁HIV定性檢測試劑盒 試劑：必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊同意、在使用期內(nèi)試劑。嚴格按說明書操作。全球當前正式用于臨床診療HIV-1 急性期感染核酸檢測試劑比較少Gen-Probe 企業(yè)生產(chǎn)Aptima HIV-1 RNA 核酸定性試劑盒Abbott企業(yè)生產(chǎn)M HIV-1 RNA/DNA 定性檢測試劑盒Roche企業(yè)生產(chǎn)COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test,v2.0hi

14、v核酸檢測技術及應用第34頁HIV核酸定性檢測 適應范圍（1）診療嬰兒早期感染（2）診療急性HIV-1感染。針對對HIV-1抗體篩查陰性、近期有流行病學史個體,或確證結果不確定樣本,核酸定性檢測可用于診療HIV-1急性期感染。（3）確定艾滋病病毒感染。針對HIV-1抗體篩查陽性或確證結果不確定個體，結合流行病學史和臨床病史，核酸定性檢測可用于HIV-1感染診療。艾滋病晚期患者可能出現(xiàn)HIV抗體反應不確定，可依據(jù)HIV核酸定性檢測結果，結合臨床病史和CD4+T淋巴細胞計數(shù)等情況，進行綜合判斷，確定臨床診療。hiv核酸檢測技術及應用第35頁結果判讀與匯報檢測結果顯示“有反應”或“檢測到”，匯報“H

15、IV-1核酸陽性” ；檢測結果顯示“無反應”或“未檢測到”，匯報“HIV-1核酸陰性”。核酸定性檢測值低于最低檢測限結果，不能排除HIV-1感染，需依據(jù)流行病學史、臨床病史和試驗室相關指標進行綜合判斷。當前我國外沒有商品化HIV-2核酸檢測試劑hiv核酸檢測技術及應用第36頁HIV定量檢測試劑盒 試劑：必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊同意、在使用期內(nèi)試劑。嚴格按說明書操作。NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃)Cobas Amplicor/Taqman (Roche，羅氏)m(Abbott，雅培)bDNA/Versant 440 (西門子)我國：凱杰（匹基），科華，

16、達安、東北制藥、萬泰 麗珠、科華等hiv核酸檢測技術及應用第37頁HIV核酸定量檢測 適用范圍（1）監(jiān)測抗病毒藥品治療效果?？共《舅幤分委熐昂?，定時病毒載量分析和監(jiān)測，結合CD4+T淋巴細胞計數(shù)，有利于抗病毒藥品治療方案確實定和修改。（2）監(jiān)測疾病進展。定時檢測HIV-1病毒載量，有利于監(jiān)測感染者和病人病程改變，結合CD4+T淋巴細胞計數(shù)，為抗病毒藥品治療提供病毒學依據(jù)。（3）診療急性HIV-1感染。針對HIV-1抗體篩查陰性、近期有流行病學史個體，或確證結果不確定，核酸定量檢測可用于診療HIV-1急性期感染。（4）確定HIV-1感染。針對HIV-1抗體篩查陽性或確證結果不確定個體，結合流行病

17、、和臨床病史和CD4+T淋巴細胞計數(shù)等，使用核酸定量檢測幫助確定HIV-1感染。hiv核酸檢測技術及應用第38頁結果判讀與匯報用于治療效果和病程監(jiān)測：檢測值小于試劑盒線性范圍下限，匯報低于檢測限，檢測值大于等于試劑盒線性范圍下限，按照檢測值匯報。 用于HIV-1感染診療：檢測值5000 CPs/ml(或IUs/ml)，匯報檢測值；檢測值5000 CPs/ml(或IUs/ml)，盡快再次嚴格按核酸檢測要求采樣檢測，匯報檢測值，結果5000 CPs/ml(或IUs/ml)，匯報檢測值，結果仍5000 CPs/ml，則需充分結合流行病學史、臨床病史、CD4+T淋巴細胞計數(shù)和HIV-1抗體隨訪檢測結果

18、等進行綜合判斷檢測值低于最低檢測限不能排除HIV-1感染。 （注：當前我國外沒有商品化HIV-2核酸檢測試劑；因為核酸定量檢測方法取得低病毒檢測值可能是核酸污染所致結果，依據(jù)我國外相關數(shù)據(jù)和報道，提議用5000 CPs/ml作為判斷結果閾值，兩次定量檢測有利于準確判斷結果）。hiv核酸檢測技術及應用第39頁集合核酸定性檢測 （Pooling PCR）對高危人群抗體檢測陰性樣品進行集合核酸檢測，可及時發(fā)覺窗口期HIV-1 感染者；用于血液篩查可深入降低“殘余危險度”該方法較單份樣品核酸檢測含有更高成本效益。hiv核酸檢測技術及應用第40頁集合PCRhiv核酸檢測技術及應用第41頁hiv核酸檢測技

19、術及應用第42頁HIV 核酸即時檢測( POCT)HIV 核酸即時檢測是在發(fā)病或者發(fā)生事件地點進行檢測，能快速取得檢測結果并及時反饋一線醫(yī)務人員一類檢測方法。POCT 檢測適用范圍廣泛，且可防止樣本長途運輸造成質量下降，非專業(yè)人員經(jīng)培訓后也可操作?？捎糜贖IV-1 感染、兒童早期HIV 感染輔助診療、疾病監(jiān)控及抗病毒藥品療效評價。hiv核酸檢測技術及應用第43頁HIV病毒載量即時檢測1hiv核酸檢測技術及應用第44頁HIV病毒載量即時檢測2hiv核酸檢測技術及應用第45頁質量確保和質量控制人員實驗室分區(qū)和環(huán)境儀器設備質量控制檢測過程質量控制外部質量控制hiv核酸檢測技術及應用第46頁試驗室分區(qū)

20、和環(huán)境 HIV-1 病毒載量檢測試驗室標準上應分為三個獨立工作區(qū)：試劑準備區(qū)、樣品處理區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)，并設在不一樣房間。嚴格要求三區(qū)空氣流向：從試劑準備區(qū)到樣品處理區(qū)，然后到擴增產(chǎn)物分析區(qū)，不能逆向流動。試劑準備區(qū)樣品處理區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)樣品加樣全自動檢測系統(tǒng)（核酸提取、試劑配置和擴增檢測）hiv核酸檢測技術及應用第47頁儀器設備質量控制加樣器、溫濕度計須經(jīng)計量部門校準，每年一次；冰箱、水浴箱用校準合格溫度計測量溫度，并做好統(tǒng)計。要定時對HIV-1 病毒載量檢測儀、實時熒光PCR 儀等儀器進行維護保養(yǎng)。hiv核酸檢測技術及應用第48頁檢測過程質量控制試劑盒有效并經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局注

21、冊，使用無DNA和RNA酶水；嚴格執(zhí)行儀器和試劑SOP，不得私自修改。HIV-1 核酸定性檢測每次試驗提議加陽性對照、陰性對照和試劑對照。定量檢測每次試驗使用試劑盒提供內(nèi)部質控品（內(nèi)標），并滿足內(nèi)部質控品要求；提議使用一個HIV-1 RNA 為500015000 cps /毫升外部質控品。hiv核酸檢測技術及應用第49頁外部質量控制PT樣品組成：每次5份，包含陰性、不一樣拷貝數(shù)陽性樣品。PT頻率：一年2次。PT樣品接收與保留：接收考評樣品后填寫接收專用單，-70度以下保留。PT樣品檢測：要求將考評樣品同試驗室常規(guī)樣品一起檢測，由常規(guī)檢測人員進行。PT結果匯報和處理：在要求時間內(nèi)上報試驗結果。P

22、T評分標準 將參加試驗室反饋結果換算成對數(shù)值（Lg），再按同一個方法與同一個考評品全部試驗室結果進行統(tǒng)計，算出平均值（M）和標準偏差（S）。hiv核酸檢測技術及應用第50頁成績判定依據(jù)每個參加考評試驗室一年兩次全部考評品結果進行綜合評分（每一個考評品評判標準依照A與B條款），判定標準為： 優(yōu)異：全部考評品沒有問題； 良好：有一個考評品滿足A中條款； 合格：兩個考評品滿足B中條款 不合格：最少有三個考評品滿足A中條款或最少一個考評品出現(xiàn)B中條款。A條款：樣品結果在M+2.0S M+3.0S內(nèi)；樣品結果在M-2.0S M-3.0S內(nèi)；考評結果匯報沒及時上報；沒按要求上報原始統(tǒng)計。B條款：樣品結果超

23、出M+3.0S；樣品結果M-3.0S；假陽性；假陰性；無效結果。hiv核酸檢測技術及應用第51頁應用實例1窗口期病例某年某月某疾控送檢一份HIV篩查陽性標本（MSM）。ELISA陽性，硒標陽性WB確證gp160,p24。兩周后隨訪， ELISA陽性，硒標陽性， WB確證gp160,p24。病毒載量51000 cp/ml。一月后再抽血復檢，ELISA陽性，硒標陽性， WB確證gp160,gp120,p66,p51,gp41,p31,p24,p17。HI病毒載量10cp/ml。hiv核酸檢測技術及應用第52頁應用實例2晚期AIDS病人樣本某年某月，某醫(yī)院送檢一份疑似HIV感染樣本，有機會感染住院病

24、人。第一次檢測ELISA陰性，報HIV抗體陰性。臨床醫(yī)師要求確證試驗，第二次檢測，ELISA和硒標均為陰性，WB：gp160,p66, p51 ，不確定。病毒載量7500 IU/ml。CD4:9個/l一個月后復檢ELISA和硒標仍為陰性， WB：p24, p51,p66，病毒載量164000 IU/ml。有艾滋病臨床表現(xiàn)，結合臨床表現(xiàn)最終臨床診療為艾滋病。進行抗病毒治療一月內(nèi)此病人已死亡hiv核酸檢測技術及應用第53頁應用實例3嬰幼兒早期診療某嬰兒年8月出生，雙親均為HIV感染者，孕3月行母嬰阻斷44天第一次核酸檢測為陽性177天第二次核酸檢測為陽性出具”嬰兒HIV感染早期診療檢測結果陽性”h

25、iv核酸檢測技術及應用第54頁應用實例4抗體假陽性病例某病例未經(jīng)過抗病毒治療，硒標陽性（某國產(chǎn)金標為陰性），酶聯(lián)陽性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB條帶（gp160,gp120）,病毒載量檢測TND1個月隨訪后硒標陽性，硒標、酶聯(lián)陽性，WB條帶（gp160,gp120）,病毒載量檢測TNDhiv核酸檢測技術及應用第55頁應用實例5抗病毒治療病例某病例抗病毒治療史不詳，硒標陽性（某國產(chǎn)金標為陰性），酶聯(lián)陽性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB條帶（gp160,gp120）,病毒載量檢測TND抗體假陽性 VS 抗體真陽性？ hiv核酸檢測技術及應用第56頁HIV核酸檢測用于診療

26、不足1若檢測目標是HIV RNA核酸輕易受抗病毒藥品影響而檢測不到接收抗病毒治療，HIV抗體確證試驗不確定樣本面臨診療困境hiv核酸檢測技術及應用第57頁復制后大量新病毒釋放到血液中hiv核酸檢測技術及應用第58頁HIV病毒儲備庫存在方式 59環(huán)狀線性整合型病毒DNA有三種存在方式儲備庫病毒處于靜止狀態(tài); 細胞內(nèi)整合HIV-1 DNA; 細胞活化后能夠釋放病毒CD45RO+/CD25-/CD69-/HLA-DR-hiv核酸檢測技術及應用第59頁HIV“治愈”定義完全治愈：體內(nèi)完全去除可復制病毒Asterilizing cure would involve total elimination o

27、f all replication-competent HIV from the body.功效性治愈：病毒未完全去除，不治療、不復制、不進展Functional cure, the virus may not have been completely eliminated but no HIV replication is detectable and individuals experience no disease progression in the absence of antiretroviral treatment.緩解： 不治療、病毒低水平(50 copies/mL)Remis

28、sion, the latest definition to enter the HIV cure dialog, refers to control of HIV viral load at low levels (such as below 50 copies/mL) in the absence of treatment. hiv核酸檢測技術及應用第60頁相關研究（內(nèi)外）：Mississippi Child CROI (March 3-6, )診療：2個獨立HIV檢測第30小時核酸定性檢測（陽性 ）第31小時載量檢測（20,000拷貝/ml）hiv核酸檢測技術及應用第61頁hiv核酸檢測

29、技術及應用第62頁功效性治愈Mississippi Child療效 EfficacyHIV RNA LDL (within 1m HIV RNA LDL 18、23-26 mHIV DNA fragments (+)HIV-specific antibodies(-)hiv核酸檢測技術及應用第63頁功效性治愈Mississippi Child密西西比兒童： CROI 41月齡，停藥22月以后，依然維持功效性治愈VL LDL (LDL=20 c/ml ，停藥23個月)HIV RNA 1 c/ml (停藥22個月)No replication-competent resting CD4 cell latent reservoir virusproviral DNA + (22個月)Very early treatment forms a barrier to the formation of HIV reservoirs in perinatal in