實(shí)驗(yàn)六腸桿菌科細(xì)菌的微生物學(xué)鑒定

1、實(shí)驗(yàn)六腸桿菌科細(xì)菌的微生物學(xué)鑒定課程名稱(chēng)：獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：6學(xué)時(shí)一、目的要求1熟悉大腸桿菌和沙門(mén)氏菌形態(tài)與染色特性以及主要培養(yǎng)特性；2熟悉大腸桿菌和沙門(mén)氏菌常規(guī)微生物學(xué)診斷法；3掌握大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生化試驗(yàn)的方法和原理；4熟悉大腸桿菌和沙門(mén)氏菌在選擇性和鑒別培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)；5熟悉沙門(mén)氏菌血清分群、定型的方法和步驟。二、知識(shí)背景腸桿菌科的細(xì)菌為革蘭氏陰性、中等大小的桿菌，運(yùn)動(dòng)者周身鞭毛；在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)好；發(fā)酵葡萄糖和碳水化合物者產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣；在麥康凱瓊脂上生長(zhǎng)；細(xì)胞色素氧化酶陰性；還原硝酸鹽為亞硝酸鹽等。碳水化合物的利用和其它生化試驗(yàn)是腸桿菌科細(xì)菌鑒定的重要試驗(yàn)。大腸埃希氏菌(

2、E.coli)簡(jiǎn)稱(chēng)大腸桿菌，作為原發(fā)和繼發(fā)病原可引起多種動(dòng)物疾?。籂倥５哪c道感染和水瀉；幼豬的水瀉和腹瀉，二月齡以上豬的出血性腸炎和水腫?。还返哪虻栏腥荆浑u的氣囊炎和大腸桿菌肉芽腫(Coligranuloma)。沙門(mén)氏菌(Salmonella),雖然沙門(mén)氏菌血清型超過(guò)2200個(gè)，但承認(rèn)的種為數(shù)不多，在O抗原的基礎(chǔ)上，沙門(mén)氏菌血清組(群)用字母A、B、C表示，然后根據(jù)它的H抗原(鞭毛抗原)再分，用阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3等表示，沙門(mén)氏菌可引起多種動(dòng)物和人的疾病，是腸桿菌科重要的致病菌，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)可引起動(dòng)物流產(chǎn)，胃腸炎和敗血癥。其它腸桿菌科成員：肺炎克雷伯氏菌(Kl

3、ebsiellapneumoniae)可引起牛乳房炎、肺炎、母馬的宮頸炎和子宮炎，這個(gè)菌常形成厚的莢膜。變形桿菌(proteus)引起動(dòng)物的尿道和胃腸道疾病。耶爾森氏菌(yersinia)引起鼠疫、胃腸炎等。生化試驗(yàn)和血清群的鑒定和定型在腸桿菌科細(xì)菌的鑒定中占很重要的位置。三、實(shí)驗(yàn)材料每6人一組，每組所需材料：1普通瓊脂斜面培養(yǎng)物2管：分別為大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(提供實(shí)驗(yàn)用菌種)；2普通肉湯2管：分別用來(lái)接種大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌；3普通瓊脂平板2個(gè)分別用來(lái)劃線接種大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌；4生化試驗(yàn)用培養(yǎng)基2套，包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)管、靛基質(zhì)，MR、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽

4、利用，硝酸鹽還原試驗(yàn)等；5三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基2管；6選擇性培養(yǎng)基2個(gè)，如：麥康凱瓊脂平板或遠(yuǎn)滕氏瓊脂平板或伊紅美藍(lán)瓊脂平板；7各種生化試驗(yàn)試劑：靛基質(zhì)試劑，MR試劑，VP試劑，硝酸鹽還原試劑；8沙門(mén)氏菌因子血清。四、操作程序1觀察大腸桿菌和沙門(mén)氏菌在瓊脂平板上的菌落特征并作描述；2觀察大腸桿菌和沙門(mén)氏菌肉湯培養(yǎng)物，注意生長(zhǎng)表現(xiàn)；3從兩種菌瓊脂平板上挑取菌落涂片作革蘭氏染色，注意菌體形態(tài)特征和染色特性；4用兩種菌瓊脂斜面培養(yǎng)物分別接種生化試驗(yàn)用的各種培養(yǎng)基以及三糖鐵瓊脂斜面（先斜面劃線再穿刺接種）；5用兩種菌肉湯培養(yǎng)物在鑒別性培養(yǎng)基平板劃線，分別用其1/2面積；6將接種的試管和平板以組為單位放

5、人37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察結(jié)果；7檢查并記錄大腸桿菌和沙門(mén)氏菌糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果及在三糖鐵瓊脂斜面/底部的生長(zhǎng)表現(xiàn)；觀察大腸桿菌和沙門(mén)氏菌在麥康凱瓊脂平板上的菌落表現(xiàn)；沙門(mén)氏菌血清群和型的鑒定。（1）分群：取一張潔凈玻片，取2滿環(huán)沙門(mén)氏菌多價(jià)O血清（AE群）至玻片上，再用接種環(huán)挑取疑為沙門(mén)氏菌的純培養(yǎng)物少許，與玻片上的多價(jià)O血清混勻，再稍動(dòng)玻片，若在2min內(nèi)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，即可初步確定該菌為沙門(mén)氏菌：同樣用生理鹽水代替多價(jià)血清作一對(duì)照，以免由于細(xì)菌的自凝而判斷錯(cuò)誤。再用代表A群（02）、B群（04）、C1群（07）、C2群（08）、D群（09）與E群（03）的O因子血清作同樣的玻片凝

6、集反應(yīng)，視其被哪一群O因子血清所凝集，則確定被檢沙門(mén)氏菌為該群。（2）定型：菌群決定后，用該群所含的各種0因子血清和被檢菌作玻片凝集反應(yīng)，以確定其含哪些0抗原。同樣，用該群H因子血清與被檢菌作玻片凝集反應(yīng)、以確定其H抗原。根據(jù)檢出的0抗原和H抗原列出被檢菌的抗原式，查對(duì)沙門(mén)氏菌的抗原表即可知被檢菌為哪種沙門(mén)氏菌，譬如某一菌的0抗原為01、4、5、12,而H抗原為i：1,2，其抗原結(jié)構(gòu)式為l,4,5,12:i:l,2，查知這個(gè)菌為鼠傷寒沙門(mén)氏菌（S.typhimuium）。一般情況下，如不要求定型，只做到定群這一步即可。在實(shí)際工作中，判定被檢菌是否為沙門(mén)氏菌，應(yīng)根據(jù)被檢菌的生化反應(yīng)和血清學(xué)診斷結(jié)

7、果結(jié)合起來(lái)考慮。凡兩者均符合沙門(mén)氏菌特性，即確認(rèn)為沙門(mén)氏菌，凡兩者中有一項(xiàng)符合沙門(mén)氏菌特性者，則可認(rèn)為是沙門(mén)氏菌。本實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌與沙門(mén)氏菌的區(qū)別、實(shí)驗(yàn)細(xì)菌、三糖鐵瓊脂斜面糖發(fā)酵M.RV.P靛基質(zhì)枸櫞酸鹽利用運(yùn)動(dòng)力斜面/底部H2S產(chǎn)生葡萄糖乳糖麥芽糖蔗糖大腸桿菌黃/黃不產(chǎn)生+一+一+沙門(mén)氏菌紅橫產(chǎn)生一一+一一+ 獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)成大榮腸桿菌科細(xì)菌檢驗(yàn)程序示意圖五、細(xì)菌特性描述菌種大腸桿菌（E.coli）沙門(mén)氏菌S.typhimurium)糖發(fā)酵葡萄糖乳糖蔗糖麥芽糖生化試驗(yàn)靛基質(zhì)M.RV.P枸櫞酸鹽利用三糖鐵瓊脂斜面菌落：。革蘭氏染色：。菌體形態(tài)：運(yùn)動(dòng)性：。（斜面/底部）的變化：糖發(fā)酵葡萄糖乳糖蔗糖麥芽糖生化試驗(yàn)靛基質(zhì)M.RV.P枸櫞酸鹽利用三糖鐵瓊脂斜面（斜面/底部）的變化：描述其主要生物學(xué)特性與生化特性菌落：革蘭氏染色：菌體形態(tài)：運(yùn)動(dòng)性：獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)成大榮 六、問(wèn)題分析1、比較大腸桿菌與沙門(mén)氏菌形態(tài)、染色特征以及在普通肉湯和普通瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)。2、大腸桿菌與沙門(mén)氏菌主要生化性質(zhì)有哪些不同？3、對(duì)本試驗(yàn)中的幾種生化實(shí)驗(yàn)的原理？4、血清型的分群和定型在腸桿菌科細(xì)菌鑒定上有何重要性？5、大腸桿菌與沙門(mén)氏菌在三糖鐵瓊脂斜面與底部生