臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：沉淀反應(yīng)

1、 沉淀反應(yīng) Precipitation9/5/2022沉淀反應(yīng)： 是指可溶性抗原和抗體特異性結(jié)合，在適當(dāng)條件下形成沉淀物的現(xiàn)象，其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)相同，包括液相沉淀試驗(yàn)和凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)。 （與凝集反應(yīng)的異同？）9/5/2022沉淀反應(yīng)的類型： 液相沉淀反應(yīng) 凝膠中沉淀反應(yīng) 免疫濁度分析 （本質(zhì)為液相沉淀反應(yīng)）9/5/2022第一節(jié) 液相沉淀反應(yīng)(fluid phase precipitation) 指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含電解質(zhì)的液體介質(zhì)中反應(yīng)，形成肉眼可見的沉淀物。9/5/2022液相內(nèi)沉淀分為 絮狀沉淀試驗(yàn) 環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 免疫濁度分析9/5/2022一、絮狀沉淀試驗(yàn)基本原理：可溶

2、性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的條件下，形成可見的絮狀沉淀物。用于抗原定性檢測(cè)或抗原抗體反應(yīng)最適比滴定。方法：玻片法和試管法。特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、不需特殊設(shè)備、靈敏度低、已被其它方法取代。表6-1 最適比方陣測(cè)定法抗體稀釋度抗原稀釋度1/101/201/401/801/1601/3201/640對(duì)照1/5+ + + + + + +1/10+ + + + + + +1/20+ + + + + + +1/40+ + + + +1/80+9/5/2022二、 環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 基本原理：將抗原溶液疊加在細(xì)小玻璃管中抗體溶液上面，抗原與抗體在兩液交界面處特異性結(jié)合，形成白色沉淀環(huán) 。主要用于抗原定性檢測(cè)。 特

3、點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、不需特殊設(shè)備、但敏感度較低，已其他方法被取代。9/5/20229/5/2022第二節(jié) 凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)(gel phase precipitation) 凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 可溶性抗原與相應(yīng)抗體分別放入凝膠內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，二者在比例合適的位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)，又稱凝膠擴(kuò)散(gel diffusion)。 9/5/2022凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)分為： 自由擴(kuò)散：?jiǎn)蜗颦傊瑪U(kuò)散試驗(yàn) 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 定向擴(kuò)散：火箭電泳 對(duì)流免疫電泳 定向-自由擴(kuò)散：免疫電泳 免疫固定電泳9/5/2022一、自由擴(kuò)散（一）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) single immunodiffsion1、基本原理 待測(cè)抗原在含有

4、相應(yīng)定量抗體的凝膠內(nèi)從局部自由向周圍擴(kuò)散，抗原抗體特異性結(jié)合，在二者比例合適的部位，形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原的濃度成正相關(guān)。 抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環(huán) 單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）9/5/20229/5/20222、技術(shù)要點(diǎn) 制板：將抗體和熱融化瓊脂混合，傾注成平板。 打孔： 加樣：待測(cè)抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品， 反應(yīng)：置37，2448h后觀察孔周圍沉淀環(huán)。9/5/20223、 數(shù)據(jù)處理 （1）Mancini曲線 適用于大分子抗原，如IgM測(cè)定，擴(kuò)散時(shí)間48h. 沉淀環(huán)直徑的平方（d2）與抗原濃度（C）呈線性關(guān)系。 9/5/2022（2）Fahey曲線 適用

5、于小分子抗原，擴(kuò)散時(shí)間較短(24h). 抗原濃度的對(duì)數(shù)（log c）與沉淀環(huán)直徑（d）呈線性關(guān)系。 9/5/20224、臨床應(yīng)用 用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等定量測(cè)定。 簡(jiǎn)單、特異，但敏感性低，已被其它方法取代。9/5/2022（二）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（double immunodiffusion）1、基本原理 將抗原和抗體溶液分別放在凝膠不同的對(duì)應(yīng)孔中，讓兩者均在凝膠中自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，濃度比例適當(dāng)處形成可見的白色沉淀線。 9/5/2022（二）技術(shù)要點(diǎn) 瓊脂傾注制板。 待瓊脂凝固后，在瓊脂膠板上打孔。 在相對(duì)的孔中分別加入抗原或抗體。 置室溫或371824h觀察沉淀線

6、。應(yīng)用（1）抗原或抗體的存在與否以及相對(duì)含量的估計(jì) （2）抗原或抗體相對(duì)分子量的估計(jì) 雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）應(yīng)用（3）抗原性質(zhì)的分析 雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）應(yīng)用（4）抗體效價(jià)的滴定 （5）抗原或抗體純度的鑒定 雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （平板法）9/5/2022（三）方法評(píng)價(jià) 方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，不需特別儀器設(shè)備，重復(fù)性好，但靈敏度稍差(1.25mg/L)。9/5/2022（四）臨床應(yīng)用1、血清學(xué)診斷:出現(xiàn)沉淀線，表明存在相應(yīng)的Ag或Ab。2.免疫化學(xué)分析：濃度、分子量、純度、抗原性質(zhì)分析和抗體效價(jià)滴定等。 9/5/2022二、定向免疫擴(kuò)散 在電場(chǎng)作用下，抗原抗體在介質(zhì)中發(fā)生定向移動(dòng)的沉淀反應(yīng)。定向、加速

7、擴(kuò)散 9/5/2022分類 對(duì)流免疫電泳 (counter immunoelectrophoresis) 火箭免疫電泳 (rocket immunoelectrophoresis) 9/5/2022(一)對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳 是雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合，在電場(chǎng)中加速定向擴(kuò)散的雙向免疫擴(kuò)散技術(shù)。 9/5/20221. 基本原理 在pH8.6的瓊脂凝膠中， 大部分蛋白質(zhì)抗原在堿性溶液中帶負(fù)電荷，且分子較小，電泳時(shí)，泳向正極。 抗體帶弱負(fù)電荷，但分子量大，電泳力小于電滲力，泳向負(fù)極。 抗原和抗體相遇，比例合適時(shí)形成肉眼可見的沉淀線。9/5/20229/5/20222.技術(shù)要點(diǎn) 制板，在瓊脂板上成

8、對(duì)打孔，加抗原和抗體。電泳后觀察結(jié)果。 9/5/20223.方法評(píng)價(jià)操作簡(jiǎn)便。靈敏度較高，比雙擴(kuò)高約10倍。分辨率低于雙擴(kuò)。9/5/20224. 臨床應(yīng)用常用于抗原或抗體的定性分析、效價(jià)測(cè)定和純度鑒定等9/5/2022(二) 火箭免疫電泳火箭免疫電泳 是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合，在電場(chǎng)中加速定向擴(kuò)散的單向免疫擴(kuò)散技術(shù)，由于其沉淀形似火箭，故稱為火箭電泳。 9/5/20221. 基本原理 電泳與反應(yīng) 抗原在電場(chǎng)作用下，在含有適量抗體的凝膠中向正極泳動(dòng)，逐漸形成梯度濃度，在抗原抗體比例適當(dāng)時(shí)形成沉淀，隨著抗原量的減少，沉淀帶越來越窄，形成火箭峰樣沉淀帶，峰形高低與抗原量呈正相關(guān)。結(jié)果分析 用已知

9、量標(biāo)準(zhǔn)抗原作對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)檢測(cè)樣品沉淀峰的高度可算出待測(cè)抗原的含量。 9/5/20229/5/20222. 技術(shù)要點(diǎn) 制板與打孔：結(jié)果：電泳完畢，觀察瓊脂板上沉淀峰，測(cè)量(從孔 中心到峰尖的高度)。計(jì)算: 以峰高為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù) 坐標(biāo))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待檢樣品抗原濃度。 電泳：樣品孔側(cè)置負(fù)極電泳。9/5/20223.方法評(píng)價(jià)操作簡(jiǎn)便靈敏度較高（mg/L）9/5/20224. 臨床應(yīng)用1. 抗原蛋白定量，如IgA、IgG、IgM檢測(cè)。2. C3、C4及其裂解產(chǎn)物檢測(cè)。3. AFP等檢測(cè) 已被免疫濁度分析取代。9/5/2022三、定向-自由擴(kuò)散是將區(qū)帶電泳與免疫擴(kuò)散相

10、結(jié)合的免疫化學(xué)分析技術(shù)。類型：免疫電泳、免疫固定電泳9/5/2022（一） 免疫電泳（immunoelectrophoresis，IEP） 將區(qū)帶電泳與雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化學(xué)分析技術(shù)。 9/5/20221. 基本原理 電泳：Ag在凝膠上進(jìn)行電泳，被分離成不同區(qū)帶。反應(yīng)：在停止電泳后，在與電泳方向平行挖一條槽，加入相應(yīng)抗血清，使抗原和抗體呈雙向擴(kuò)散，在二者比例合適處形成肉眼可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，可分析、鑒定樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。9/5/20229/5/20222. 技術(shù)要點(diǎn)制板與打孔：加樣：加入待檢抗原標(biāo)本或正常血清對(duì)照。電泳：抗原一端接陰極，電泳1.5

11、2h。反應(yīng)：挖一小槽，向槽內(nèi)加入抗體，使抗原抗體雙向擴(kuò)散。觀察結(jié)果：放置24h后，觀察沉淀線的數(shù)目、形狀和位置。 9/5/20229/5/20223、方法評(píng)價(jià) 特異、分辨率高抗體質(zhì)量很關(guān)鍵（量足夠、效價(jià)等）9/5/20224. 臨床應(yīng)用主要用于：純化抗原或抗體的成分分析。異常體液中蛋白質(zhì)分析，如無丙種球蛋白血癥、白血病等病人的血清蛋白成分的分析。 9/5/2022(二) 免疫固定電泳（immunofixation electrophoresis） 區(qū)帶電泳與免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合的免疫分析技術(shù)。 1、原理： 似免疫電泳，不同之處是電泳后直接將抗體作用于被分離的各組分蛋白質(zhì)，抗Ag-Ab發(fā)生反應(yīng)，使

12、Ag在電泳位置上被免疫固定。9/5/20222. 技術(shù)要點(diǎn) 電泳： 先將抗原作區(qū)帶電泳，分離成不同區(qū)帶。沉淀反應(yīng):電泳后，將Ab加于蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，Ag與Ab發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成的CIC嵌于固相支持物中。洗去游離的Ag或Ab，顯示出被結(jié)合固定的某種蛋白質(zhì)。 左圖為IgG 型, 中圖為IgG 型，右為正常 SPGAM SPGAM SPGAM 免疫固定電泳示意圖9/5/20223、方法評(píng)價(jià)簡(jiǎn)便、快速（1h）靈敏度高于免疫電泳9/5/20224.臨床應(yīng)用可用于鑒定具有近似遷移率的多種蛋白 如各種M蛋白、補(bǔ)體的裂解產(chǎn)物、免疫球蛋白的輕鏈型別；腦脊液、尿液或其他體液中微量蛋白的檢測(cè)與鑒定。 9/5/202

13、2第三節(jié) 免疫濁度分析技術(shù)（immunoturbidimetry） 免疫濁度測(cè)定 是將液相內(nèi)的沉淀試驗(yàn)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動(dòng)分析技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的一項(xiàng)分析技術(shù)。當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)的抗體特異結(jié)合，可以形成不溶性的CIC，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。用儀器檢測(cè)濁度，推算出復(fù)合物的量。 9/5/2022免疫濁度測(cè)定按測(cè)量方式分為 透射免疫比濁法 （turbidimetric immunoassay或turbidimetry） 散射免疫比濁法 （nephelometric immunoassay或nephelometry）Ag+Ab“電解質(zhì)”IC（ 19S）濁度IC 濁度 待測(cè)Ag量Ab稍微過量且固定 待測(cè)抗

14、原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)濁度的檢測(cè)分析免疫透射比濁法（turbidimetry） （吸光度）免疫散射比濁法（nephelometry） 自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng)入射光線 樣品 被吸收、反射、折射 減弱 吸光度與IC量呈正相關(guān)，IC量與參與反應(yīng)的抗原的量呈函數(shù)關(guān)系（抗體過量且固定濃度）。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。（一）原理一、免疫透射比濁法 （二）技術(shù)要點(diǎn)1.稀釋標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原（5個(gè)濃度）.2.加適當(dāng)過量抗血清，反應(yīng)完成后，測(cè)各管A340nm。3.計(jì)算機(jī)處理:按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，計(jì)算出抗原濃度。（三

15、）方法評(píng)價(jià) 優(yōu)點(diǎn): 靈敏度提高，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確。（較單擴(kuò)法和火箭電泳而言） 不足: 抗體用量較大（過量）； IC要足夠大(35-100nm)、足夠多； 耗時(shí)較長(zhǎng)。 吸光度或散射光強(qiáng)度與待測(cè)抗原濃度呈正相關(guān)（一）原理二、免疫膠乳比濁法（二）方法評(píng)價(jià)敏感度高，可達(dá)ng/L水平，操作簡(jiǎn)便，易自動(dòng)化；RF可致非特異性凝集，用F(ab)2片段代替IgG即可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現(xiàn)象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。(一) 原理三、免疫散射比濁法光線照射 微粒子 反射和折射 散射光 散射光強(qiáng)度：與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素密切相關(guān)原理

16、：1、保證抗體過量； 2、避開不穩(wěn)定階段； 3、抗原過量的檢測(cè)時(shí)段檢測(cè)分兩個(gè)在抗原抗體預(yù)反應(yīng)時(shí)段，加小量樣本， （7.5s2min）測(cè)定第一次散射光信號(hào)值加全量樣本，約反應(yīng) 2分鐘后，第二次測(cè)定散射光信號(hào)信號(hào)峰值計(jì)算機(jī)處理轉(zhuǎn)換為樣品濃度(二)定時(shí)散射比濁法（fixed time nephelometry） 儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn) 抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段： 1/10量標(biāo)本，7.5120s內(nèi)，散射光信號(hào)閾值，才行下一步，否則稀釋后再行測(cè)定。(2) 反應(yīng)階段：全量標(biāo)本測(cè)定，全過程需4min(3) 信號(hào)檢測(cè) ：計(jì)算機(jī)換算為待測(cè)抗原濃度定時(shí)散射比濁法的抗原過量檢測(cè) 抗體適當(dāng)過量（抗體結(jié)合抗原的能力可達(dá)到50倍于待

17、測(cè)標(biāo)本正常血清濃度）。 (2)檢測(cè)分階段進(jìn)行，第一階段加小量樣本，并對(duì)檢測(cè)峰值進(jìn)行閾值限定 ，超過閾值即進(jìn)行稀釋檢測(cè)。原理：抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法。速率：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)形成IC量（不是IC總量）速率峰值的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。（三）速率散射比濁法（rate nephelometry）累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率 5 810 13 515 251220 603525 1509030 2308035 300 7040 360 6045 415 5550 450 4555 480 3060 500 20 抗原抗體復(fù)合物形成的速率儀器測(cè)定技術(shù)要點(diǎn) 開啟機(jī)器，進(jìn)行定

18、標(biāo) 反應(yīng)階段 ：動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)速度抗原過量檢測(cè)-加入標(biāo)本反應(yīng)結(jié)束后再加入標(biāo)準(zhǔn)抗原，看是否出現(xiàn)第二個(gè)速率峰抗體過量第一峰值信號(hào)(四)散射比濁法方法評(píng)價(jià) 散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動(dòng)化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過量檢測(cè)方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴, 對(duì)抗體的質(zhì)量要求很高。 1.抗體的質(zhì)量 （高質(zhì)量R型抗體）2.抗原抗體比例（抗體適當(dāng)過量） 3.反應(yīng)條件（PH值、離子強(qiáng)度） 4.增濁劑的使用 （種類、濃度合適） 5.標(biāo)本因素。（偽濁度產(chǎn)生原因？）免疫比濁分析的影響因素 四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用免疫比濁分析臨床應(yīng)用免疫球蛋白檢測(cè)：IgG、IgA、IgM、鏈、鏈、免疫球蛋白亞類；補(bǔ)體檢測(cè):C3、C4；血漿蛋白檢測(cè):前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍(lán)蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列。9/5/2022沉淀反應(yīng)液相沉淀反應(yīng) 自由擴(kuò)擴(kuò)散：?jiǎn)螖U(kuò)、