丹參對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟水通道蛋白2表達(dá)的影響

1、丹參對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟水通道蛋白-2表達(dá)的影響【摘要】目的討論腎臟水通道蛋白-2(AQP-2)的表達(dá)與糖尿病腎病大鼠水液代謝異常及丹參防治作用的機(jī)制。方法60只安康SD大鼠分為正常組(10只)，剩余50只采用高糖高脂飼料刺激加小劑量STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型成功30只，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、觀察組每組各10只；免疫組織化學(xué)檢測AQP-2在各組大鼠腎臟中的分布及蛋白質(zhì)的表達(dá)；RT-PR方法檢測各組大鼠AQP-2RNA的表達(dá)，并以-atin相對(duì)定量。結(jié)果腎臟免疫組化顯示，AQP-2主要在腎臟的集合管表達(dá)。在4組動(dòng)物的腎臟AQP-2蛋白質(zhì)相對(duì)陽性面積：正常組(0.1190.035)，模型組(0.1

2、880.027)，對(duì)照組(0.1580.036)，觀察組(0.1540.033)和RNA正常組(0510004)，模型組(0.810.059)，對(duì)照組0.780.090，觀察組0.700.027的表達(dá)上觀察組較模型組均下調(diào)P0.01。結(jié)論在糖尿病模型大鼠腎臟組織中AQP-2表達(dá)增多，AQP-2的增多可能參與了糖尿病多尿的形成。丹參對(duì)水通道蛋白的表達(dá)有下調(diào)作用，這可能是其利水作用的機(jī)制，也是其防治糖尿病腎病的基?！娟P(guān)鍵詞】糖尿病腎?。凰ǖ赖鞍?；丹參；鏈脲佐菌素糖尿病腎病diabetinephrpathy,DN是糖尿病diabetesellitus,D最常見的微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者主要的死亡

3、原因之一。DN的根本病變是細(xì)胞外基質(zhì)(Extraellularatrix，E)在腎小球、腎小管積聚導(dǎo)致腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)增多，出現(xiàn)結(jié)節(jié)型與彌漫型腎小球硬化。本研究觀察丹參對(duì)STZ實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠AQP-2蛋白程度和基因程度的表達(dá)、尿白蛋白排泄率的改變，旨在討論AQP-2的表達(dá)改變與糖尿病腎病水液代謝異常的關(guān)系以及丹參的調(diào)節(jié)效應(yīng)，為DN的預(yù)防、治療提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SXK(軍)2002-005)60只，體質(zhì)量為(16512.5)g。SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，環(huán)境溫度為225，12/12h晝夜規(guī)律，按每籠5只喂養(yǎng)。2方

4、法2.1動(dòng)物分組及糖尿病模型的建立隨機(jī)將大鼠分為2組：正常組10只；糖尿病造模組(D)50只；正常組進(jìn)食普通飼料。糖尿病模型組進(jìn)食高糖高脂飼料，即普通飼料中參加10的豬油、10的葡萄糖、1的膽固醇、2的蛋黃粉、0.2的膽酸鈉。糖尿病造模組大鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后尾靜脈注射低劑量STZ(30gkg，Siga公司)1次。該模型具有中度高血糖、高血脂、胰島素抵抗以及典型的糖尿病腎病改變等特點(diǎn)1。以注射后1個(gè)月血糖值持續(xù)高于7.8lL，尿糖、尿蛋白陽性者為模型建立成功，共選出成模動(dòng)物30只，隨機(jī)分到模型組，對(duì)照組和觀察組3個(gè)組中，每組10只成模率為60。2.2動(dòng)物的給藥及飼養(yǎng)灌胃劑量按大鼠用藥劑量

5、為人的10倍計(jì)算。對(duì)照組：每日灌服格列吡嗪5gkg；觀察組：每日灌服丹參5.5gkg。正常組和模型組灌服等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間，正常組動(dòng)物自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飲食，模型組、治療組、觀察組動(dòng)物給予高糖高脂飲食，自由飲水。2.3腎臟組織的留取實(shí)驗(yàn)第16周末時(shí)，用25%烏拉坦麻醉大鼠，翻開腹腔,從腹主動(dòng)脈取血,充分暴露手術(shù)視野在腹腔的兩側(cè)找到腎臟，將部分標(biāo)本迅速放入4多聚甲醛中固定，用于石蠟切片。余下部分用消毒鋁箔包好迅速放入液氮中，保存于-80冰箱中，備用于總RNA的提齲2.4腎臟組織學(xué)分析腎組織HE染色。鏡下觀察腎臟組織的一般形態(tài)構(gòu)造，腎小球、腎小管、間質(zhì)有無組織學(xué)異常。2.5免疫組織化學(xué)腎組織免疫

6、組織化學(xué)染色(試劑盒均購自武漢博士德生物工程)。按照免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)展加樣,以SAB法進(jìn)展檢測。先滴加150稀釋的AQP-2一抗，4過夜。滴加試劑2(羊抗鼠IgG)，室溫放置30in。再滴加試劑3(SAB)，室溫放置30in。最后DAB顯色。細(xì)胞漿中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反響，圖像采用iaspr圖像分析系統(tǒng)分析。所有切片放大倍數(shù)為1000。每組取6只動(dòng)物，每只動(dòng)物AQP-2染色各取2張切片，觀察3個(gè)視野。視場面積為4800002，測定陽性面積比Aa(%)(陽性面積視野面積)。表1AQP2的表達(dá)Aa(%)(陽性面積比)和24h尿蛋白排泄率(略)轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.6逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

7、反響(RT-PR)總RNA提取:采用TaKaRa公司消費(fèi)的一步法提取總RNA試劑盒，按照試劑盒說明書取200g腎臟組織進(jìn)展操作提取總RNA，用紫外分光光度法測定RNA濃度，RNA濃度=D260n-D280n稀釋倍數(shù)0.04g/l，并用D260/D280計(jì)算RNA污染程度R，R在1.82.0之間;RNA濃度計(jì)算：RNA濃度=A260值40gl50；RT(逆轉(zhuǎn)錄)：AQP-2引物(由寶生物工程大連合成)，上游：5-GTTTTTGTTTTTTGG-3，下游：5-GGTGAGGGGAAAGAGGTA-3。-atin引物合成：上游：5-TTTGGGTATGGAATT-3，下游：5-GGAGAATGATT

8、TGATTT-3;逆轉(zhuǎn)錄反響：按照試劑盒說明書進(jìn)展DNA逆轉(zhuǎn)錄反響，逆轉(zhuǎn)錄反響參加試劑含25l/Lgl22l、10RTBuffer1l、RNaseFreedH23.75l、dNTPixture各10l/L1l、RNaseInhibitr40U/l0.25l、AVReverseTransriptase5U/l0.5l、特異性下游引物20pl0.5l、提取總RNA樣本1.0l作為模板，總體積10l，反響條件為4230in、955in、55in一個(gè)循環(huán)，-20保存?zhèn)溆?；擴(kuò)增半定量多聚酶鏈反響：反響條件95預(yù)變性3in，9445s、6040s、7245s30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72延伸3in。擴(kuò)增完畢

9、后20g/L瓊脂糖凝膠檢測，在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照保存，BI-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)(BI-RAD公用)采集圖像并進(jìn)展分析。PR檢測結(jié)果以經(jīng)-atin校正后的A值表示。ark為TaKaRa公司的DNAarkDL2000。2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示。SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析，采用ne-ayANVA法進(jìn)展方差分析。兩兩比擬時(shí)根據(jù)其方差是否齊性選擇LSD方差齊性或Dunnett方差不齊方法。P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.124h尿蛋白排泄率狀況模型組大鼠24h尿蛋白排泄率最高。動(dòng)物的24h尿蛋白排泄率較模型組明顯降低，模型組、對(duì)照組和觀察組24h尿蛋白排泄率均高于正常組。3.

10、2大鼠腎臟的病理改變腎臟的HE染色可見對(duì)照組大鼠為正常的腎臟組織構(gòu)造，模型組腎臟損害為片狀分布，以髓袢偏髓質(zhì)的近曲小管為主的上皮細(xì)胞空泡狀變性、腫脹，腎小球內(nèi)可見紅細(xì)胞淤積，病變嚴(yán)重的部位腎小管上皮細(xì)胞脫落。對(duì)照組上皮細(xì)胞空泡狀變性較模型組輕，但腎小球內(nèi)紅細(xì)胞淤積未見改善，觀察組上皮細(xì)胞空泡狀變性較模型組輕，腎小球內(nèi)少見紅細(xì)胞淤積的情況，腎小管未見上皮細(xì)胞脫落。3.3AQP-2在腎臟的蛋白質(zhì)表達(dá)對(duì)大鼠腎臟的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示,AQP-2蛋白在腎臟的集合管表達(dá),而在腎小球和腎間質(zhì)未見表達(dá),與已往報(bào)道一致2。模型組大鼠腎臟AQP-2蛋白的免疫組化染色結(jié)果顯示,沿集合管內(nèi)壁上皮細(xì)胞分布的棕黃色

11、顆粒比對(duì)照組明顯顏色加深而濃重,分布面積更廣泛。上述結(jié)果說明模型組大鼠腎臟AQP-2在蛋白質(zhì)程度上表達(dá)增強(qiáng)。對(duì)照組和觀察組AQP-2的棕黃色程度比模型組要淺的多P0.05，結(jié)果見圖1及表1。3.4大鼠腎臟AQP-2RNA的表達(dá)RTPR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,模型組大鼠腎臟髓質(zhì)AQP2RNA的表達(dá)明顯高于正常組,分別為0.810.059和0.510004(P0.01)。觀察組0.700.027明顯低于模型組(P0.05)，為該結(jié)果與腎臟AQP-2免疫組織化學(xué)的結(jié)果相一致。結(jié)果見圖2。4討論AQP已被證實(shí)是一組對(duì)水有高度選擇性的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是跨膜水運(yùn)的重要通道，這為研究糖尿病腎病水代謝的異常提供了新

12、的角度。目前研究說明，尿液濃縮稀釋功能由腎臟集合管主細(xì)胞的AQP-2來完成，而AQP-2的表達(dá)主要受加壓素(antidiuretihrnevaspressin，AVP)的調(diào)節(jié)。AVP與腎臟集合管主細(xì)胞基底膜上的AVPV2受體結(jié)合后，使細(xì)胞內(nèi)AP濃度升高，激活PKA，將AQP-2蛋白磷酸化，使之從囊泡穿梭到管腔膜，從而進(jìn)步集合管對(duì)水的通透性3，同時(shí)該信號(hào)通路激活REB元件，刺激AQP-2的合成，表現(xiàn)為AQP-2RNA和蛋白程度的進(jìn)步，從而實(shí)現(xiàn)AVP的抗利尿作用。既往研究說明在D大鼠中血AVP程度升高4，這可能與水鈉潴留有關(guān)。從理論上講,D大鼠血漿浸透壓升高,刺激VP分泌增加,促進(jìn)腎小管對(duì)水的重吸

13、收,以降低血漿浸透壓,同時(shí)進(jìn)步尿浸透濃度,尿量減少。而實(shí)際上對(duì)于D大鼠來說,這種負(fù)反響機(jī)制在早期處于代償狀態(tài),VP代償性升高,在晚期那么處于失代償狀態(tài),盡管有回吸收水分的傾向,但尿量仍然增加。VP對(duì)AQP2的調(diào)節(jié)包括短期調(diào)節(jié)和長期調(diào)節(jié),本研究中D大鼠AQP2的RNA表達(dá)增加,促使AQP2合成增加,導(dǎo)致水通透性增加,尿量增加,應(yīng)屬于長期調(diào)節(jié)。祖國醫(yī)學(xué)所認(rèn)識(shí)的消渴病日久出現(xiàn)的“水腫“脹滿“尿濁“關(guān)格與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的糖尿病腎病的臨床病癥相似。丹參之脂溶性成分包括丹參酮、水溶性成分丹參素、原兒茶醛、丹參酚酸B，研究證實(shí)丹參增加腎血流、有利尿和抗炎作用，可降低血BuN、Sr，調(diào)節(jié)腎組織部分微循環(huán)，改善腎功能。臨床觀察證實(shí)，丹參在改善早期DN患者的水腫、血液流變學(xué)等病癥、降低FPG、BuN、UAER、Sr上都有很好的療效5，6。孫興隆等7研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮可抑制腎成纖維細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞內(nèi)膠原合成率。本研究結(jié)果說明丹參能顯著降低糖尿病腎病大鼠24h尿蛋白排泄率。病理提