發(fā)酵乳中乳酸菌的選擇性計數(shù)及分離鑒定

1、PAGE PAGE - 4 -發(fā)酵乳中乳酸菌的選擇性計數(shù)及分離鑒定發(fā)酵乳是以生牛(羊)乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)發(fā)酵不同，發(fā)酵乳通過添加嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等乳酸菌作為發(fā)酵劑加快發(fā)酵乳的發(fā)酵過程1。乳酸菌對人體的健康有很多益處，有助于增加腸道微生物的定植，治療和預防腹瀉、緩解便秘、增強人體的的免疫力等2-3，但是乳酸菌需要達到一定數(shù)量才能起到保健作用，因此發(fā)酵乳中的活菌數(shù)尤其重要。為保證足夠數(shù)量活的益生菌到達腸道中，GB19302、ISO27205等國內(nèi)外相關(guān)機構(gòu)規(guī)定，發(fā)酵乳中益生菌的數(shù)量不得少于106CFU/mL4。近年來發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，為

2、提升發(fā)酵乳的品質(zhì)，乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌加入發(fā)酵乳中以增加產(chǎn)品的芳香味道和保健功能等1，因此需要簡單、可靠的方法來確保商業(yè)發(fā)酵乳中發(fā)酵劑微生物和功能性微生物的含量，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。目前對于發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的檢測主要包括分子生物學定量分析方法、丙二醇甲醚醋酸酯/疊氮溴化乙錠結(jié)合實時定量等非培養(yǎng)方法，以及傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法。非培養(yǎng)方法是以乳酸菌的基因組核酸序列或細胞中的活菌數(shù)為基礎(chǔ)的鑒別方法，往往對儀器設(shè)備具有較高的要求5。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是基于乳酸菌的理化特性，實現(xiàn)對乳酸菌的選擇性分離，操作簡便、設(shè)備依賴度低，適于廣泛推廣應用3-6。但是目前傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，往往存在培養(yǎng)基選擇性差、計數(shù)結(jié)果不準確等

3、問題。因此根據(jù)不同乳酸菌的特性優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基，結(jié)合菌種鑒定技術(shù)，實現(xiàn)發(fā)酵乳中乳酸菌的種水平活菌計數(shù)具有重要意義。本文主要聚焦市售發(fā)酵乳中常用的乳酸菌組合，通過驗證和比較國內(nèi)外標準、文獻中選擇性培養(yǎng)基的選擇性，并采用快速鑒定、形態(tài)學特征、生理生化和分子生物學特征等方法確定復合菌發(fā)酵乳中的不同種類乳酸菌的活菌數(shù)，為復合菌發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。同時為政府監(jiān)管、行業(yè)標準法規(guī)制定提供技術(shù)支撐，對乳酸菌在乳品行業(yè)更加安全和廣泛的應用具有重要意義。2.3選擇性培養(yǎng)基對目標菌種的選擇性本研究中，嗜熱鏈球菌的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基M17和MC對嗜熱鏈球菌都具有良好的選擇性。但計數(shù)結(jié)果顯示，3個樣品中M1

4、7培養(yǎng)基的計數(shù)結(jié)果均高于MC培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富，有利于發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌的復蘇，其中高濃度的甘油磷酸鈉不僅具有良好的緩沖作用，還能抑制發(fā)酵乳中其他乳酸菌如保加利亞乳桿菌的生長15-16，MC培養(yǎng)基以碳酸鈣作為緩沖劑，緩沖能力較弱，粉末容易沉淀或結(jié)塊，會影響菌落生長17。國際標準和相關(guān)文獻多數(shù)推薦采用M17培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌計數(shù)18。含有萬古霉素的MRS培養(yǎng)基對干酪乳桿菌具有良好的選擇性。干酪乳桿菌的選擇性計數(shù)主要根據(jù)其理化特性設(shè)計選擇性培養(yǎng)基，如劉愛萍等6研究表明以D-核糖為唯一碳源的培養(yǎng)基對干酪乳桿菌具有良好的選擇性。本文依據(jù)干酪乳桿菌的萬古霉素固有耐藥實現(xiàn)對干酪乳桿菌選擇性的計

5、數(shù)。該選擇性培養(yǎng)基的應用前提為發(fā)酵乳中含有嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌和干酪乳桿菌。當發(fā)酵乳中含有其他萬古霉素固有耐藥的乳桿菌，如發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌19，該方法則不適用。酸化MRS培養(yǎng)基對不同發(fā)酵乳中德氏乳桿菌的計數(shù)結(jié)果準確性存在差異，該培養(yǎng)基ISO7889中規(guī)定對德氏乳桿菌保加利亞亞種的分離計數(shù)，該方法適用于發(fā)酵乳中只含有嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種，不具有普遍性。嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和部分雙歧桿菌等乳酸菌在酸化MRS培養(yǎng)基上也可以較好的生長嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和部分雙歧桿菌等在酸化MRS培養(yǎng)基上也可以較好的生長20。為更好的選擇性分離德氏乳桿菌保加利亞亞種，在后續(xù)實驗

6、中可通過提高乙酸鈉的含量、采用改良RCM培養(yǎng)基等方法提高計數(shù)的準確性21-22。GB4789.352022中規(guī)定，MRS培養(yǎng)基用于測定雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的總數(shù)，嗜熱鏈球菌的總數(shù)采用MC培養(yǎng)基。3個樣品的MRS培養(yǎng)基上均檢測到嗜熱鏈球菌，MRS培養(yǎng)基中的蛋白胨、牛肉粉、酵母粉和葡萄糖，可以為嗜熱鏈球菌的生長提供碳源、氮源等相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)，不能選擇性的計數(shù)乳桿菌和雙歧桿菌。俞漪等5提出可通過形態(tài)特征進行乳桿菌和厭氧菌的區(qū)分，提出在厭氧培養(yǎng)下，乳桿菌呈乳白色，較大，嗜熱鏈球菌呈半透明狀，較小，在乳酸菌計數(shù)的過程中可通過菌落形態(tài)特征實現(xiàn)乳桿菌計數(shù)。3結(jié)論本研究以3種復合發(fā)酵乳為研究對象，采用不同的選擇性培養(yǎng)基，結(jié)合MALDI-TOFMS快速鑒定和細菌多相鑒定技術(shù)，實現(xiàn)了發(fā)酵乳中不同乳酸菌的選擇性計數(shù)及種水平的精準鑒定。研究表明M17培養(yǎng)基和雙歧桿菌培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌具有良好的選擇性，可以對實現(xiàn)復合發(fā)酵乳產(chǎn)品中乳酸菌的精準計數(shù)。德氏乳桿菌的選擇性計數(shù)較難，需進一步優(yōu)化培養(yǎng)基或采用分子生物學方法等進行準確計數(shù)。本研究中選擇性培養(yǎng)基應用前提為發(fā)酵乳產(chǎn)品的菌種種類標識范圍。若乳酸菌