核酸擴(kuò)增技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用與進(jìn)展

1、核酸擴(kuò)增技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用與進(jìn)展近10余年來(lái)現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅猛開展，為臨床實(shí)驗(yàn)室診斷提供了較為可靠的核酸檢測(cè)方法。經(jīng)典聚合酶鏈反響(PR)擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷；然而，由于污染問題嚴(yán)重，擴(kuò)增抑制物的存在，試劑盒缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、標(biāo)準(zhǔn)化，加之技術(shù)、條件、質(zhì)控等方面因素影響，其敏感性、特異性差異頗大，人們對(duì)其可信度、可靠性產(chǎn)生了疑心，給臨床醫(yī)生診斷結(jié)核病帶來(lái)了一定的困惑。為此，國(guó)外學(xué)者開發(fā)出具有高度敏感性、特異性、標(biāo)準(zhǔn)化、商品化的PR擴(kuò)增試劑盒；繼PR之后，又開展了幾種新的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)?，F(xiàn)就其在結(jié)核病診斷方面的應(yīng)用與進(jìn)展作一介紹，供廣闊同道借鑒。一、PR為根底擴(kuò)增反響即RheApl

2、ir結(jié)核分支桿菌PR試驗(yàn)(AplirpR)AplirPR系應(yīng)用生物素標(biāo)記位于結(jié)核分支桿菌16SrRNA基因中高度保守區(qū)域種特異性引物擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌復(fù)合群DNA中584bp序列；生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子(aplin)與種特異性DNA探針進(jìn)展雜交后，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫技術(shù)進(jìn)展比色鑒定，結(jié)果判斷以450n波長(zhǎng)時(shí)吸光度(A450)0.350為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)13。AplirpR是由瑞士Rhe公司開發(fā)研制的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化試劑盒，該試劑盒有三個(gè)不同的小盒：標(biāo)本處理盒、擴(kuò)增盒和鑒定盒。為防止穿插污染，廠商推薦試劑制備、標(biāo)本處理、擴(kuò)增與鑒定應(yīng)三室分開，此外，應(yīng)用尿嘧啶-N-糖基化酶控制擴(kuò)增子攜帶污染。研究說明，Aplirp

3、R可檢出少至210個(gè)結(jié)核分支桿菌中DNA。與培養(yǎng)法相比，AplirpR檢測(cè)臨床標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌DNA的敏感性為76.7%97.8%，特異性達(dá)97.7%99.3%，陽(yáng)性預(yù)計(jì)值(PPV)66%93%，陰性預(yù)計(jì)值(NPV)98%98.6%24，6。假設(shè)參考臨床綜合診斷，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為66.7%85.4%、99.6%100%、91.7%100%、96.8%98.6%，該方法至少與培養(yǎng)法一樣敏感1，46。對(duì)于涂陽(yáng)標(biāo)本，AplirpR敏感性(97.6%98%)顯著高于涂陰標(biāo)本(40%53%)4，6。該方法還可對(duì)涂陽(yáng)標(biāo)本應(yīng)用種特異性探針對(duì)結(jié)核分支桿菌和非結(jié)核分支桿菌(TT)早期進(jìn)展

4、菌種鑒定2，4。AplirpR整個(gè)過程僅需7小時(shí)左右，用于檢測(cè)BATE培養(yǎng)基中結(jié)核分支桿菌較核酸探針雜交試驗(yàn)提早4天以上4。法國(guó)學(xué)者arpentier等5對(duì)AplirpR進(jìn)展多中心研究，結(jié)果顯示，其檢測(cè)肺外標(biāo)本(尿、胸腹液、腦脊液等)、涂陽(yáng)標(biāo)本、涂陰標(biāo)本及培陽(yáng)標(biāo)本的敏感性分別為83%、94.5%、74%、95%，特異性達(dá)98%。AplirpR不僅具有高度敏感性、特異性和可重復(fù)性，而且操作簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴設(shè)備，無(wú)放射性污染問題；然而，其靈敏度較經(jīng)典PR稍低，可能系標(biāo)本量較少及存在抑制因子所致。AplirpR在方法學(xué)上仍需進(jìn)一步自動(dòng)化以防止手工重復(fù)操作。二、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增反響即基因探針擴(kuò)增直接試驗(yàn)(A

5、TDT)ATDT是由美國(guó)加州Gen-Prbe公司開展起來(lái)的由DNA介導(dǎo)的等溫rRNA擴(kuò)增法，擴(kuò)增子應(yīng)用吖啶酯(aridinuester,AE)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光探針(AE-DNA探針)進(jìn)展核酸雜交保護(hù)實(shí)驗(yàn)(hybridizatinprtetinassay,HPA)，通過照度計(jì)檢測(cè)雜交探針的相對(duì)發(fā)光值(ralativelightunits,RLU)，以RLU3104判斷為陽(yáng)性。該rRNA序列在核酸中存在2103拷貝數(shù)，應(yīng)用ATDT可使特異性靶rRNA序列擴(kuò)增109倍，其檢測(cè)低限為每l10個(gè)13。由該公司消費(fèi)的商品化試劑盒應(yīng)用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAL)和十二烷基硫酸鈉(SDS)對(duì)標(biāo)本進(jìn)展消化與去

6、污染處理，且該過程在單管中進(jìn)展，這樣也防止了標(biāo)本間可能的穿插污染；該試劑盒能直接用于各種臨床標(biāo)本的檢測(cè)，整個(gè)過程僅需5小時(shí)便可完成。與培養(yǎng)法相比，ATDT檢測(cè)臨床標(biāo)本敏感性為92.9%100%，特異性為90.1%98.7%；結(jié)合臨床綜合判斷，ATDT敏感性、特異性、PPV、NPV分別達(dá)83.9%100%、97.6%100%、80.7%100%、96.3%99.3，其敏感性與培養(yǎng)法相等或稍高13，7，9。研究說明，ATDT檢測(cè)肺外標(biāo)本(胸腹液，腦脊液)的敏感性和特異性與肺部標(biāo)本大致相仿(P0.05)，并不低于培養(yǎng)法；把標(biāo)本量從50l增加到500l，然后進(jìn)展離心，可明顯進(jìn)步該試驗(yàn)結(jié)果的敏感性，而不

7、影響其特異性7，8。日本學(xué)者Abe等10比擬了經(jīng)典PR和ATDT檢測(cè)痰標(biāo)本結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ATDT檢測(cè)總陽(yáng)性率達(dá)91.9%，高于經(jīng)典PR法(84.2%)。ATDT檢測(cè)未經(jīng)抗結(jié)核治療臨床標(biāo)本的敏感性高于抗結(jié)核治療者，即隨著化療的進(jìn)展，象涂片和培養(yǎng)一樣ATDT逐漸陰轉(zhuǎn)，然而，有少數(shù)患者持續(xù)陽(yáng)性，考慮可能系死菌核糖體蛋白保護(hù)了16SrRNA，而使ATDT能檢測(cè)出無(wú)力菌中的rRNA，因此，該方法不能用于監(jiān)測(cè)化療效果7。由于ATDT不能鑒別結(jié)核分支桿菌和TT，也不能進(jìn)展藥敏試驗(yàn)，因此不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)法8。三、連接酶鏈反響(ligasehainreatin,LR)DNA連接酶具有將兩條DNA單鏈連接在一起并與

8、互補(bǔ)鏈結(jié)合的功能。1991年，Barany利用穩(wěn)定Taq連接酶，借助PR原理，首先建立了LR；此后，美國(guó)芝加哥Abbtt實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出半自動(dòng)商品化LR診斷試劑盒(Abbttlx)11，12。LR擴(kuò)增的靶序列位于編碼蛋白抗原b的染色體基因中，該基因?yàn)榻Y(jié)核分支桿菌復(fù)合群所特有。在Lx擴(kuò)增體系中，成對(duì)設(shè)計(jì)的四條寡核苷酸探針識(shí)別并與之互補(bǔ)的單鏈結(jié)核分支桿菌靶序列(標(biāo)本制備所暴露的)進(jìn)展雜交，每對(duì)寡核苷酸探針均應(yīng)用不同半抗原進(jìn)展標(biāo)記，一條含有捕獲半抗原，用于捕獲靶序列；另一條含有檢測(cè)半抗原，為了檢測(cè)。當(dāng)一對(duì)探針與DNA一條單鏈上蛋白抗原b基因靶序列雜交時(shí)，在探針之間有幾個(gè)寡核苷酸的縫隙，聚合酶在寡核苷酸充

9、填這個(gè)縫隙起作用，一旦縫隙被充填，連接酶能共價(jià)地連接這對(duì)探針形成擴(kuò)增產(chǎn)物，這樣，擴(kuò)增產(chǎn)物的一端含有了捕獲半抗原，而另一端那么含有檢測(cè)半抗原，該產(chǎn)物與原有靶序列互補(bǔ)，其本身又可做為下一次擴(kuò)增循環(huán)的靶源，如此往復(fù)，靶序列呈指數(shù)性增長(zhǎng)1113。擴(kuò)增反響在Lx熱循環(huán)儀中進(jìn)展，941秒，641秒，6940秒，共37個(gè)循環(huán)；LR擴(kuò)增產(chǎn)物在Abbttlx分析儀上通過微粒酶聯(lián)免疫測(cè)定法進(jìn)展檢測(cè)，以樣本熒光率/分界值(標(biāo)準(zhǔn)熒光率0.30)(S/)1.0為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。Lx可直接用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)；對(duì)臨床確診的結(jié)核患者，其檢測(cè)呼吸道標(biāo)本的敏感性、特異性、PPV、NPV分別為90.8%98.97%、98.97%100%

10、、96.96%100%、94.7%99.62%；檢測(cè)肺外標(biāo)本之敏感性、特異性、PPV、NPV分別為73.33%、100%、100%、97.06%；其敏感性(89.36%90.8%)較培養(yǎng)法(82.9%88.2%)和涂片法(78.72%)均高11，12。晚近，挪威學(xué)者Lindbrathen等13應(yīng)用LR檢測(cè)482份臨床標(biāo)本，與培養(yǎng)相比，其檢測(cè)涂陽(yáng)標(biāo)本、涂陰標(biāo)本的敏感性分別為96.7%、72%；結(jié)合臨床綜合判斷，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為90.7%、99.2%、97.4%、96.7%；此外，14份TT培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本LR均為陰性，其中包括2份海魚和潰瘍分支桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本，提示LR對(duì)結(jié)核

11、分支桿菌復(fù)合群最具特異性。LR具有以下特點(diǎn)：(1)快速：5小時(shí)內(nèi)可出結(jié)果；(2)檢測(cè)呼吸道和非呼吸道標(biāo)本均具有高度敏感性和特異性；(3)可進(jìn)展分支桿菌菌型鑒定：涂片陽(yáng)性而LR陰性那么提示為TT感染，不必等待培養(yǎng)結(jié)果；(4)污染少：該擴(kuò)增系統(tǒng)是完全密閉的，因此，不存在穿插污染或攜帶污染；(5)LR可檢出無(wú)活力菌中DNA，因此，不合適于化療的隨訪；(6)LR要求整個(gè)靶序列必須，一個(gè)核苷酸的錯(cuò)配，可阻止兩條單鏈的連接，因此，LR可準(zhǔn)確檢測(cè)基因序列中單個(gè)基因突變。四、鏈替代擴(kuò)增反響(stranddisplaeentaplifiatin,SDA)SDA是一種新的等溫體外DNA擴(kuò)增方法，1992年由美國(guó)學(xué)

12、者alker等14首先建立，根本原理如下：靶DNA序列經(jīng)加熱變性后，引物與其對(duì)應(yīng)DNA單鏈雜交(退火)，在聚合酶作用下產(chǎn)生帶Hin識(shí)別位點(diǎn)含5和3末端的靶DNA序列，該靶序列進(jìn)入SDA循環(huán)。首先由Hin限制性核酸內(nèi)切酶切割識(shí)別位點(diǎn)，依賴DNA聚合酶在切割處延伸3端，并替代另一條DNA鏈；該替代鏈與引物雜交后又依次做為另一擴(kuò)增反響的靶源，這些步驟在反響體系中不斷重復(fù)，使靶DNA序列呈指數(shù)性增長(zhǎng)；374023次循環(huán)后，2小時(shí)內(nèi)靶序列可得到108擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)生物素標(biāo)記DNA探針雜交后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試驗(yàn)進(jìn)展檢測(cè)，其檢測(cè)純化DNA低限為550個(gè)基因拷貝數(shù)15。1994年，alker等15進(jìn)一步

13、對(duì)SDA進(jìn)展了改進(jìn)，應(yīng)用SDA同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)靶DNA序列(16SrDNA序列和IS6110序列)和一個(gè)內(nèi)對(duì)照靶序列，即復(fù)合SDA(SDA)系統(tǒng)，通過接合器(adapter)介導(dǎo)在不同靶序列末端連接上共同引物序列，這樣一對(duì)引物便擴(kuò)增了不同靶序列，從而，有助于鑒別結(jié)核分支桿菌和TT。Badak等16應(yīng)用SDA檢測(cè)分支桿菌生長(zhǎng)指示試管(GIT)培養(yǎng)系統(tǒng)中結(jié)核分支桿菌和TT，敏感性為97.2%，特異性96.1%。有作者應(yīng)用SDA擴(kuò)增IS6110序列檢測(cè)294份痰標(biāo)本，敏感性達(dá)95%100%，特異性為84%98%17。日本Ihiyaa等18對(duì)半自動(dòng)BDPrbeTe-SDA系統(tǒng)和AplirpR檢測(cè)痰標(biāo)本中分

14、支桿菌進(jìn)展了比擬，結(jié)果顯示，SDA和AplirpR檢測(cè)結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本之敏感性分別為94.7%和89.5%，特異性分別為99.8%和100%；29份鳥復(fù)合型分支桿菌(A)培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，SDA陽(yáng)性24份(敏感性82.8%)，AplirpR陽(yáng)性23份(敏感性79.3%)，特異性分別為98.3%和100%；該SDA系統(tǒng)可同時(shí)擴(kuò)增48份臨床標(biāo)本，且整個(gè)過程僅需6小時(shí)。SDA和PR一樣受共同實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)如靶序列長(zhǎng)度、靶序列dGd含量、引物序列、細(xì)菌裂解技術(shù)等的影響，因此，也給該擴(kuò)增技術(shù)帶來(lái)了一定的局限性。五、QB復(fù)制酶擴(kuò)增法QB復(fù)制酶是源于QB噬菌體中的RNA依賴的RNA聚合酶，該酶具有復(fù)制

15、限制性RNA分子的作用。1994年，美國(guó)學(xué)者Shah等首先建立QB復(fù)制酶擴(kuò)增法，接著用于檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的研究19。其根本原理如下：首先合成兩條單鏈與結(jié)核分支桿菌23SrRNA5區(qū)域一樣靶序列互補(bǔ)的捕獲探針A和B，設(shè)計(jì)一條含有與23SrRNA一個(gè)區(qū)域互相補(bǔ)的檢測(cè)探針；在擴(kuò)增前應(yīng)用可逆性靶捕獲技術(shù)(RT)去除標(biāo)本基質(zhì)中可能的抑制因子，降低TT非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用，進(jìn)步擴(kuò)增的特異性。RT的詳細(xì)步驟如下：首先捕獲探針A、檢測(cè)探針與靶序列進(jìn)展雜交，形成的三重雜交子被一含有反配體的順磁性顆粒所捕獲，經(jīng)洗脫后釋放出檢測(cè)探針-靶雜交子；該雜交子又與捕獲探針B進(jìn)展雜交，所形成的捕獲探針B-檢測(cè)探針-靶三重雜交子被

16、另一順磁性顆粒捕獲、洗脫后重新被釋放，接著，該三重雜交子再連續(xù)地經(jīng)過兩次捕獲、洗脫過程，最終釋放出的檢測(cè)探針-靶雜交子或檢測(cè)探針經(jīng)QB復(fù)制酶擴(kuò)增后呈指數(shù)性增長(zhǎng)，在36.5小時(shí)內(nèi)靶RNA序列可得到109擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用熒光計(jì)進(jìn)展檢測(cè)；該方法可檢出103純化結(jié)核分支桿菌rRNA，相當(dāng)于每反響管1FU，檢測(cè)痰標(biāo)本低限為10100FU/5l1921。Shah等20應(yīng)用手工QB復(fù)制酶擴(kuò)增法檢測(cè)臨床標(biāo)本，與培養(yǎng)法相比，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為97.1%、96.5%、80.5%、99.5%；根據(jù)臨床確診結(jié)果，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為97.3%、97.8%、87.8%、99.5%

17、，敏感性高于培養(yǎng)法(91.9%)。最近，美國(guó)Gene-Trak公司制造出全自動(dòng)QB復(fù)制酶擴(kuò)增包裝試劑盒；Sith等21，22應(yīng)用該試劑盒檢測(cè)冷凍痰標(biāo)本，其敏感性、特異性、PPV、NPV分別為79%、98%、97%、85%；同時(shí)對(duì)780份臨床呼吸道標(biāo)本(痰、BALF)進(jìn)展了檢測(cè)，其敏感性為84%，特異性達(dá)97%。QB復(fù)制酶擴(kuò)增法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)快速：36.5小時(shí)可得結(jié)果；(2)特異性強(qiáng)：僅結(jié)核分支桿菌rRNA擴(kuò)增反響陽(yáng)性，而TT和其它細(xì)菌RNA均得不到擴(kuò)增；(3)結(jié)果不受標(biāo)本中抑制劑的影響：痰或其它臨床標(biāo)本在擴(kuò)增前經(jīng)RT技術(shù)使探針-靶序列得到高度純化，4個(gè)循環(huán)后，可使抑制劑降低1012101

18、6倍；這樣，在擴(kuò)增時(shí)可允許多量標(biāo)本進(jìn)展檢測(cè)，因此，QB復(fù)制酶擴(kuò)增法更合適于檢測(cè)涂陰培陽(yáng)標(biāo)本。由于該方法所擴(kuò)增的模板為23SrRNA，其在死菌中同樣可能受到核糖體蛋白的保護(hù)而穩(wěn)定一段時(shí)間，因此，QB復(fù)制酶擴(kuò)增法能否用于化療效果的監(jiān)測(cè)仍有待進(jìn)一步討論。六、結(jié)語(yǔ)與展望綜上所述，核酸擴(kuò)增技術(shù)以其敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便向人們充分展示了其在結(jié)核病臨床診斷中的宏大優(yōu)越性。AplirpR和ATDT已在國(guó)外臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室普遍開展應(yīng)用，并獲得了令人滿意的效果。由PR衍生的幾種新的分子診斷技術(shù)(LR、SDA、QB復(fù)制酶擴(kuò)增法等)正逐步由實(shí)驗(yàn)室過渡到臨床。核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種新興的開展中的診斷技術(shù)，在不少方面仍有待

19、改進(jìn)與完善，如方法學(xué)上進(jìn)一步自動(dòng)化、簡(jiǎn)單化，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件與參數(shù)，不斷改進(jìn)檢測(cè)手段，拓寬應(yīng)用范圍(分支桿菌菌型鑒定、藥敏試驗(yàn)、化療效果的監(jiān)測(cè)等)，開發(fā)更為實(shí)用的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒等。隨著分子生物學(xué)的不斷開展，相信該技術(shù)不久將成為診斷結(jié)核病的常規(guī)方法。參考文獻(xiàn)2IhiyaaS,NuaY,TaadaY,etal.EvaluatinfGen-PrbeaplifiedybateriutuberulsisdirettestandRhePR-irellplatehybridizatinethd(Aplirybateriu)frdiretdetetinfybateria.Jlinirbil,1996,34:130-

20、133.3VurinenP,iettinenA,VaentR,etal.DiretdetetinfybateriutuberulsisplexinrespiratryspeiensbyGen-PrbeaplifiedybateriutuberulsisdirettestandRheAplirybateriutuberulsistest.Jlinirbil,1995,33:1856-1859.5arpentierE,DruillardB,Daillux,etal.Diagnsisftuberulsisbyaplirybateriutuberulsistest:aultienterstudy.Jl

21、inirbil,1995,33:3106-3110.7GabaF,anterlaJ,VinadB,etal.DiretdetetinfybateriutuberulsisplexinnnrespiratryspeiensbyGen-Prbeaplifiedybateriutuberulsisdirettest.Jlinirbil,1997,35:307-310.8PfyfferGE,KisslingP,JahnEI,etal.Diagnstiperfranefaplifiedybateriutuberulsisdirettestitherebrspinalfluid,thernnrespira

22、try,andrespiratryspeiens.Jlinirbil,1996,34:834-841.9EhlersS,IgnatiusR,RegnathT,etal.DiagnsisfextrapulnarytuberulsisbyGen-Prbeaplifiedybateriutuberulsisdirettest.Jlinirbil,1996,34:2275-2279.10Abe,HiranK,ada,etal.DetetinfybateriutuberulsisinlinialspeiensbyPRandGen-Prbeaplifiedybateriutuberulsisdirettest.Jlinirbil,1993,31:3270-3274.12TrtliE,LaviniaF,SinettiT,etal.Evaluatinfaerialligasehainreatinkit(AbbttLx)frdiretdetetinfybateriutuberulsisinpulnaryandextrapulnaryspeiens.Jlinirbil,1997,35:2424-2426.14alkerGT,FraiserS,ShraJL,etal.Stranddisplaeentaplifiatin-anistheal,invitrDNAaplifiat