衛(wèi)生化學(xué)課件：第四章 分子熒光分析法

1、第四章 分子熒光分析法第一節(jié) 概述第二節(jié) 基本原理第三節(jié) 影響熒光測定的因素第一節(jié) 概述吸收輻射能后處于電子激發(fā)態(tài)的分子以發(fā)射輻射的方式釋放能量回到基態(tài)，這一現(xiàn)象稱為發(fā)光（光致發(fā)光 photoluminescence）。最常見的兩種發(fā)光現(xiàn)象是分子熒光（molecular fluorescence）和分子磷光（ molecular phosphorescence）。根據(jù)激發(fā)光的波長不同，即物質(zhì)接受的電磁輻射能量大小不同，所發(fā)射的熒光就不同，分析方法也不同，可分為X射線熒光分析法、紫外-可見熒光分析法和紅外熒光分析法等。根據(jù)發(fā)熒光的粒子不同，又可分為分子熒光分析法和原子熒光分析法。本章介紹分子的紫

2、外-可見熒光分析法。熒光分析法（fluorescence analysis）就是利用熒光特性和強(qiáng)度，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。第二節(jié) 基本原理一、分子熒光的發(fā)生定義 某些物質(zhì)分子吸收了一定波長的光能之后，基態(tài)電子躍遷到激發(fā)態(tài)，很快以無輻射躍遷的形式下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級。再由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級下降到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級，同時(shí)發(fā)射出比原來所吸收的頻率較低波長較長的光能，這種光稱為熒光。分子的去激發(fā)過程 使分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的輻射稱為激發(fā)光。 分子被激發(fā)到較高的能級后不穩(wěn)定，將以不同途徑釋放多余的能量回到基態(tài)，這個(gè)過程即為分子的去激發(fā)過程。去激發(fā)過程包括下面幾個(gè)可能的

3、途徑：（1）振動(dòng)弛豫、（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換、（3）熒光發(fā)射、（4）外轉(zhuǎn)換、（5）系間跨躍、（6）磷光發(fā)射1、激發(fā)光譜 熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)所得的光譜曲線為激發(fā)光譜。它反映了在某一固定的發(fā)射波長下，不同激發(fā)波長激發(fā)的熒光的相對效率。激發(fā)光譜可以用于熒光物質(zhì)的鑒別，并作為進(jìn)行熒光測定時(shí)供選擇恰當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長。2、熒光光譜熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，熒光波長為橫坐標(biāo)所得的光譜曲線為熒光光譜。它反映了在相同的激發(fā)條件下，不同波長處分子的相對發(fā)射強(qiáng)度。熒光（發(fā)射）光譜可以用于熒光物質(zhì)的鑒別，并作為熒光測定時(shí)選擇恰當(dāng)?shù)臒晒鉁y定波長或?yàn)V光片。二、激發(fā)光譜與熒光光譜3、鏡象關(guān)系 兩種光譜成鏡象對稱，是由于大多吸收

4、光譜的形狀表明了分子的第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級結(jié)構(gòu)，而熒光發(fā)射光譜則表明了分子基態(tài)的振動(dòng)能級結(jié)構(gòu)。能量在基態(tài)的振動(dòng)能級上分布情況和在第一電子激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級上分布相似，這樣就出現(xiàn)了熒光光譜的形狀和激發(fā)光譜的形狀非但極為相似，而且兩者形成鏡象。 熒光光譜一般比吸收光譜更簡單，缺少了一些短波長的吸收峰。而且與分子是否被激發(fā)至更高激發(fā)態(tài)無關(guān)，即熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)都應(yīng)同時(shí)具備兩個(gè)條件：一是物質(zhì)分子必須有強(qiáng)的紫外-可見吸收；二是物質(zhì)具有較高的熒光效率（fluorescence efficiency）。 1、熒光物質(zhì)對光輻射的吸收，服從于朗伯比爾定律，即 I / I0 = 10

5、-abc熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度 = I0 I = I0 1 10 -abc 2、熒光效率：激發(fā)態(tài)分子中發(fā)射熒光的量子數(shù)占吸收激發(fā)光的量子總數(shù)的比例，數(shù)值在0-1之間。 = 發(fā)出的光量子數(shù) / 吸收的光量子數(shù)三、熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 3、F = K I0 1 10 -abc 當(dāng)abc0.05，I0一定時(shí) F = K C此式僅適用于低濃度的情況，此時(shí)熒光強(qiáng)度與溶液濃度關(guān)系曲線為一直線。I0IFCb4、內(nèi)濾效應(yīng)和熒光猝滅效應(yīng)當(dāng)濃度增大至一定限度時(shí)，熒光強(qiáng)度與溶液濃度關(guān)系曲線將彎向濃度軸。曲線彎曲的原因是多方面的，主要是由于內(nèi)濾效應(yīng)和熒光猝滅效應(yīng)等造成的。內(nèi)濾效應(yīng)是指樣品濃度過大時(shí)，使熒光在未射出樣

6、品池之前就被溶液中未被激發(fā)的熒光物質(zhì)所吸收（自吸收）而引起的熒光強(qiáng)度隨濃度下降的現(xiàn)象。樣品濃度越大，內(nèi)濾效應(yīng)越顯著。熒光猝滅效應(yīng)，即熒光分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間相互作用，使熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑。熒光猝滅包括動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。四、熒光強(qiáng)度的測定用于測量熒光強(qiáng)度的儀器種類很多，有簡單的濾光片熒光光度計(jì)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的精密熒光分光光度計(jì)之分。儀器的部件包括下列四個(gè)基本部分 激發(fā)光源 樣品池 檢測器 濾光片或單色器。由光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)單色器分光后得到特定波長的激發(fā)光，然后入射到樣品使熒光物質(zhì)激發(fā)產(chǎn)生熒光，通常在90度方向上進(jìn)行熒光測量。經(jīng)發(fā)射單色器分光后使熒光

7、到達(dá)檢測器而被檢測。一 光源 測量熒光強(qiáng)度所用的激發(fā)光源一般要比測量吸光度中所用的光源強(qiáng)度強(qiáng)。二 單色器 1、激發(fā)單色器 其作用是獲得單色性較好的激發(fā)光以激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光，即選擇激發(fā)波長。 2、發(fā)射單色器 其作用在于把由激發(fā)光所發(fā)生的反射光、溶劑的散射光以及溶液中雜質(zhì)產(chǎn)生的熒光濾去，只讓樣品溶液所發(fā)生的熒光通過而照射于檢測器上。1/2TmaxTmax0T帶通型濾光片Tmax1/2TmaxtT截止型濾光片三 樣品池通常用石英制成，因?yàn)闊晒庥凶贤鈪^(qū)的，普通玻璃會吸收。樣品池為四面透光的方形石英池。四 檢測器用光電管或光電倍增管作檢測器。新一代熒光光譜儀中使用了電荷偶合元件檢測器，可一次獲得熒光二維

8、光譜。 一 定性熒光分析法定性時(shí)，一定要有標(biāo)準(zhǔn)品作對照。熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長和所發(fā)射的最強(qiáng)熒光波長是鑒定物質(zhì)的根據(jù)，也是定量測定時(shí)的最靈敏的條件。五、熒光分析法的定性和定量二 定量若被測物本身發(fā)生熒光，則可以通過直接測量其熒光強(qiáng)度來測定該物質(zhì)的濃度。 大多數(shù)的無機(jī)化合物和有機(jī)化合物，它們或不發(fā)生熒光，或熒光效率很低而不能直接測定，可采用間接測定的方法。 無機(jī)化合物：例如對氟、硫及鈹、鎵、硒等稀土元素的測定。 有機(jī)化合物：芳香族化合物、胺類、甾族化合物、蛋白質(zhì)、酶與輔酶、維生素及多種藥物等的測定。定量方法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 在測定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，常采用系列中某一標(biāo)準(zhǔn)溶液作為基礎(chǔ)，將空白溶液的熒光強(qiáng)

9、度讀數(shù)調(diào)至0%，將該標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度讀數(shù)調(diào)至100%或50%，然后測定系列中其他各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。 （2）直接比較法 得第三節(jié) 影響熒光測定的因素一、物質(zhì)結(jié)構(gòu)和溶劑的影響 影響物質(zhì)熒光強(qiáng)度的因素主要有兩個(gè)：一、分子結(jié)構(gòu)；二、發(fā)光分子所處的環(huán)境。 1、分子結(jié)構(gòu)：只有那些具有共軛雙鍵的分子有利于發(fā)射熒光。而飽和的或只有孤立雙鍵的化合物，不呈現(xiàn)顯著的熒光。 2、溶劑因素：同一種熒光物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度都有差別。二、測定條件的影響 1、濃度：在F與C的關(guān)系中提出，僅適用于低濃度的情況，另外濃度增大，由于內(nèi)濾效應(yīng)和熒光猝滅效應(yīng)等引起曲線彎曲。 2、酸度：帶有酸性或堿性環(huán)狀取代基的芳香化合物的熒光一般都與pH值有關(guān)，有些化合物在離子狀態(tài)時(shí)不顯熒光，因此，在利用熒光強(qiáng)度作測定時(shí)，溶液的pH值的嚴(yán)格控制是非常重要的，需通過實(shí)驗(yàn)來確定。 3、溫度：因此在測定過程中盡可能保持溫度恒定并選擇低溫條件進(jìn)行熒光檢測。三、共存物質(zhì)的干擾 1、熒光的熄