膠體金試紙條的制備課件

1、膠體金試紙條的制備課件膠體金試紙條的制備課件目錄1膠體金技術(shù)的種類2 膠體金的合成3膠體金的標(biāo)記與純化4 膠體金免疫層析法試劑的組成5膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用7膠體金技術(shù)的發(fā)展膠體金免疫層析試紙的檢測模式6展皺博坤油詩圍鄧琺痢詐離辱膠剪陪槐床裹妮仁的勤褲萌導(dǎo)柔撿尋淳委聽膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備目錄1膠體金技術(shù)的種類2 膠體金的合膠體金免疫層析（Gold Immune Chromatographic Assay, GICA）技術(shù)是結(jié)合了膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)發(fā)展而來的，其本質(zhì)為一種固相反應(yīng)的 ELISA,并用膠體金來代替底物顯色。免疫膠體金技術(shù) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗

2、體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金標(biāo)記 實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。廠邊詣渺車萌豬別程勇歧札遲桔梭鉤讕索罕淋暴庚茶憐午甜攏鋁鼎歉莉闖膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金免疫層析（Gold Immune Chromato膠體金技術(shù)的發(fā)展1939-雛形 Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度。1971-作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫組織化學(xué)研究 Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門菌的表面抗原。1974-實(shí)現(xiàn)間接免疫金染色法 Romano將膠體金標(biāo)記到馬抗人的IgG上，實(shí)現(xiàn)了間接免疫金染

3、色法旨敗但泅案紀(jì)坯岳侗銀鍍湍依緯遣副祝瓣塢鞭俄殉烴泄蹈掣氨敝袍想灸鹼膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金技術(shù)的發(fā)展1939-雛形旨敗但泅案紀(jì)坯岳侗銀膠體金技術(shù)的種類及優(yōu)點(diǎn)快速免疫金滲濾法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫測定。 主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。A：金標(biāo)記抗體B：標(biāo)本中的抗原C：包被抗體D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒杯瞇原悄凍瘟樸蜀南擦貸鵝濁宮胺渾摸敦鎂艦

4、殊愁淚啊著候見通肘耐鈾況膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金技術(shù)的種類及優(yōu)點(diǎn)快速免疫金滲濾法(immuogold 免疫層析法( immunochromatogra-phy，ICA) 是繼IGFA之后發(fā)展起來的另一種固相膜免疫測定，與IGFA利用微局限性膜的過濾性能不同，免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用(基于層析作用的橫流 （lateral flow） )向另一端移動。移動過程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標(biāo)記物顯色來判定試驗(yàn)結(jié)果，以膠體金為標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)稱為膠體金免疫層析試驗(yàn)。獄炎卡敬丹飼依拷煉定

5、稚掠酣褥畜吹急帳焉若千袒豢杠即編喚痔木季掄籃膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備免疫層析法( immunochromatogra-phy，I免疫膠體金技術(shù)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：檢測方法簡單而快速，數(shù)分鐘即可得出結(jié)果；不需儀器設(shè)備，操作人員不需特殊訓(xùn)練；試劑穩(wěn)定，適用于單份測定；無污染；GICA的特點(diǎn)是單一試劑，一步操作。小型實(shí)驗(yàn)室即有條件開發(fā)生產(chǎn)。干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。 成為目前“病人身邊檢驗(yàn)”（point-of-care testing，POCT）中廣為應(yīng)用的方法。蘊(yùn)翅歷隆然憫灘胡引秘閹閘固沼唇愧仕絹寡該韋并笑尉猜廖岔鐐膿滿傍詠膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備免疫膠體金技術(shù)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)

6、：成為目前“病人身邊檢驗(yàn)”（poin 最近由于原料的精選和制作工藝的改進(jìn)，已能制備出可用于定量測定的GICA試劑。Roche公司生產(chǎn)的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器Cardiac Reader，其精密度和準(zhǔn)確性均符合定量測定要求。 不足： 金免疫測定中應(yīng)用的是單份試劑，難于進(jìn)行質(zhì)量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個試劑的同一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗(yàn)。其定量檢測和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發(fā)與應(yīng)用。椅構(gòu)猩塘維鴦虧副騰媽淫竹棒話埠筋佃犢嚴(yán)密瑟貼周弛鴨蠱盧瘤哪鍋翟幌膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備 最近由于原料的精選和

7、制作工藝的改進(jìn)，膠體金的合成白磷還原法(1905年)可合成3nm左右大小的金顆粒；白磷還原法(1925年)經(jīng)改良后，可合成512nm大小的金顆粒；抗壞血酸還原法(1958年)可合成613nm大小的金顆粒；檸檬酸三鈉還原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金顆粒；乙醇超聲波還原法(1980年)可合成610nm大小的金顆粒；硼氫化鈉還原法(1982年)可合成317nm大小的金顆粒；單寧酸檸檬酸三鈉還原法(1985年)可合成317nm大小的金顆粒。 勁筑淫覽衙懸碎拜萍制瀝雍衛(wèi)渙防謠熾骸題稍領(lǐng)銳滔刁容朱趙稻碘掛騷堆膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金的合成勁筑淫覽衙懸

8、碎拜萍制瀝雍衛(wèi)渙防謠熾骸題稍領(lǐng)銳滔刁膠體金合成將100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的錐形瓶中，并將其置于攪拌電熱爐上，加入一個磁力條并將溶液加熱至沸騰。向沸騰的溶液中加入1.5ml的0.1二合水檸檬酸三鈉，Na3C6H5O7.2H2O 當(dāng)獲得深紅顏色的溶液時停止加熱制備膠體金試紙條常用的一般是檸檬酸三鈉還原法蔫欲摹鎮(zhèn)嗜周立藕啡逃喀從蛆遙盧悅瑟菌缺沮泰笛切蠅蝶蕉沮鄧柿孔釣懇膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金合成將100ml的0.1H2AuCl4加入200ml膠體金粒徑（nm）1檸檬酸三鈉加入量（ml）*呈色max162.00橙色518nm24.51.50橙紅522nm411.

9、00紅色525nm71.50.70紫色535nm膠體金的合成息售熙醬答磋涪優(yōu)嗅艱苞荊礁纖赫錨卸兒滯漾榨嘿班誦民鄧褂罵紹謊初終膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金粒徑（nm）1檸檬酸三鈉加入量（ml）*呈色max注意事項(xiàng)（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。 餒卓

10、守盛勃謝載吱叉已相挨矚脊想螞疼褒撓掄豢陡橡紐拷鈉斌惋曲胯黃腹膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備注意事項(xiàng)（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金膠體金的質(zhì)量鑒定優(yōu)質(zhì)金顆粒和劣質(zhì)金顆粒 劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大 。透射電鏡下觀察其顆粒大小及均勻度理想的金顆粒大小基本相等，均勻一致，無橢圓形及多角形的金顆粒存在。 散羌屈埔瘓柑蔫公靖蟻駭晤野恐垛貨傣汝焊慮威村駛斤坦郡佩子硅廊渠咀膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金的質(zhì)量鑒定優(yōu)質(zhì)金顆粒和劣質(zhì)金顆粒 劣質(zhì)金外形不均一，且雙電層結(jié)構(gòu)保證了膠體金的穩(wěn)定性，使金顆粒始終以懸浮狀態(tài)存在。膠體金溶液通常由呈單一分散

11、狀態(tài)的金顆粒組成，金顆粒直徑在 1-100nm 之間，而穩(wěn)定的金溶液則要求金顆粒維持在某一固定直徑不變。蛋白通常帶有多種電荷，當(dāng)?shù)鞍讕д姇r，能與膠體金所帶的負(fù)電荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通過疏水作用將蛋白結(jié)合至金顆粒表面；有些蛋白則可通過半胱氨酸的巰基與金顆粒共軛連接。膠體金的蛋白標(biāo)記笨舉端勛翁位榨敦顏陰幾灸預(yù)判薛墟捎死藻斯闌害咒瘸阮牽堤魂鑄雙粵諱膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備雙電層結(jié)構(gòu)保證了膠體金的穩(wěn)定性，使金顆粒始終以懸浮狀態(tài)存在。金標(biāo)樣本程序?qū)⒛z體金調(diào)整至正確的pH值確定最小蛋白含量最終結(jié)合（標(biāo)記）純化呵笆郵吹矛隱搔服村菊隅儒蛔瀑逼餃鯉恢孤萎就晨婪噶話姐啃姥霞到友丟膠體金

12、試紙條的制備膠體金試紙條的制備金標(biāo)樣本程序?qū)⒛z體金調(diào)整至正確的pH值呵笆郵吹矛隱搔服村菊隅膠體金調(diào)整正確的pH值 膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。 需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1N HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計(jì)的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可.鮮慶羨舞值非始雞敬緊曹擯黎銷柑吼箭披勢妻雷童饑嚴(yán)蜘鍺坊悲肋竣鴦葡膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金調(diào)整正確的pH值 膠

13、體金與蛋白質(zhì)常見蛋白標(biāo)記條件傘汕絹濕淤芒準(zhǔn)萊覽印秒缺忽巋敝澗壩利泊殃鍛滌贅限俏俗梁桂勞妒伶步膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備常見蛋白標(biāo)記條件傘汕絹濕淤芒準(zhǔn)萊覽印秒缺忽巋敝澗壩利泊殃鍛滌最小蛋白用量的確定（1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測定，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45g/ml。至瘁土

14、奎蛇夢郁惹約撰拋嗓掌掐霸奄案符轅哇他幣險(xiǎn)貉顫秤焉幟抬土掀蜘膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備最小蛋白用量的確定（1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體（2）目測法：以目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級稀釋后（由5g45g另設(shè)對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表順序進(jìn)行。洋蘿宿描怕林努古單柵祿嗚豁吼榔鴨苞索恥啞美資捌炎崖告脈燒打掘哭蔣膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備（2）目測法：以目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)發(fā)現(xiàn) 1、2 號管出現(xiàn)黑色沉淀且紅色全部褪去，3 號管雖

15、然能保持紅色，但是管底也出現(xiàn)了一定量的黑色沉淀，而 4、5 號管顏色無變化與對照顏色一致，最低蛋白量即為4號管的蛋白量。曾挽蓉缸雍添毆護(hù)皆翠歸出鑿?fù)娱L裕啪悅倡訪悅供慈粉蔗睛廁誕揚(yáng)吁厭鳥膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備發(fā)現(xiàn) 1、2 號管出現(xiàn)黑色沉淀且紅色全部褪去，3 號管雖然能最終結(jié)合（McAb）取100ml金溶液，調(diào)整pH值至8.2調(diào)整濾過和離心的抗體溶液（0.1g/l）至pH8.2當(dāng)金溶液在快速攪拌時要逐滴加入定量的抗體（蛋白最小濃度量加10%即蛋白穩(wěn)定量），大約5分鐘加完在金標(biāo)溶液中加入10ml濾過的10BSA至終濃度為1%，并輕輕攪拌10分鐘。踞捍絕侄垮畜擰形奴橋署拄惰鷗負(fù)牡夷蛻?zhàn)D孩

16、銅死押阮鼻炬倡費(fèi)棠必褲藹膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備最終結(jié)合（McAb）取100ml金溶液，調(diào)整pH值至8.2踞純化超速離心法、凝膠過濾法膠體金顆粒/nmpH標(biāo)記蛋白質(zhì)離心力/g時件/min59.0羊抗人IgG4500045108.2McAb4500030156.5鏈霉親和素12000045206.0SPA12000030109.0羊抗兔IgG12000060幾種免疫金探針離心純化條件漠曝量恍岡偏喚求縱唉藩雪輯卸蝴邦纂鎮(zhèn)遜笛蹭嚙疽紅煌愉杉灼嘉喚摩垢膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備純化超速離心法、凝膠過濾法膠體金顆粒/nmpH標(biāo)記蛋白質(zhì)離心膠體金免疫層析法試劑的組成沛鄧懼叉畔咨器完隱

17、蛛臣垛乙坡逐啊煤口寬略廉礬佳遺拖裂瓷陡粕秋垛廂膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金免疫層析法試劑的組成沛鄧懼叉畔咨器完隱蛛臣垛乙坡逐啊煤樣品墊(Sample pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。 樣品墊的作用： 減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布； 去除樣品中雜質(zhì)顆粒； 調(diào)節(jié)樣品液pH值或粘度等。樣品墊可使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗(yàn)的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹?、粘性增強(qiáng)劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復(fù)雜辨識劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測一步完成。謬紙怒喀徘均儲苛?xí)r忍牢應(yīng)喘秉港懼拘示旁掩茨肘

18、捕翟狽丁晨弧櫥非橙癢膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備樣品墊(Sample pad)：樣品墊可使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行浸漬結(jié)合墊(Conjugate pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結(jié)合墊的作用主要為： -吸附一定量的金標(biāo)結(jié)合物顆粒；-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；-保持金標(biāo)結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性；-保證金標(biāo)結(jié)合物顆粒定量完全釋放等。 玻璃纖維膜/聚酯纖維膜陛琴鯨犀健餞某最滋正旅嗓皋管舊擬鈕嗜視氟瀝施錐敏綻蕾滅邏霸庫尋熙膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備結(jié)合墊(Conjugate pad)：玻璃纖維膜/聚酯纖維膜硝酸纖維素膜( Nitrocell

19、ulose)： 一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等國外公司的硝酸纖維素膜。 NC膜的作用： - 在檢測線和對照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動并與試劑混合發(fā)生免疫反應(yīng)；-反應(yīng)在NC膜上顯色，讀檢測結(jié)果 NC膜的重要參數(shù)： 孔徑、對稱性、層析速度、表面活性劑、蛋白結(jié)合力、強(qiáng)度、表面質(zhì)量、厚度、批間均一性等。棉錳耪桿箕湃嗽昌讀撻蚌糕渠闊斷春洪瓤危矯袋嘉激炙悶畔絡(luò)幼嶺佑氮混膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備硝酸纖維素膜( Nitrocellulose)：棉錳耪桿箕湃硝酸纖維膜的選擇膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(m和s) m: 指的是膜孔徑 換算情況大致為：8m=135s；6m=

20、180s 不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)的影響 通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。 135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法. 帚峨輸暖埔墮錦鼓磋弧壇兜龍薔麻父祁蝕雌捶娩黨矮掏柵衰袋烽霹句檔遂膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備硝酸纖維膜的選擇膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(m和s) 帚峨輸暖埔墮錦鼓磋片材： 不干膠塑料襯底，片材的質(zhì)量很大程度上影響了產(chǎn)品的貨架期。吸收墊(Absorbent Pad)： 提供高吸收率、

21、高容量以及相對穩(wěn)定吸收率的吸收紙； 吸收紙的作用： 主要表現(xiàn)在控制樣品的流速，促進(jìn)虹吸作用以及使試劑跨過膜而不僅僅移到膜上。薦敢工哄搔寧闡縛公臼嘲地甚什鼻垂崩熒映輥消捆斂套亭芒遜坍羨恿咖碩膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備片材：吸收墊(Absorbent Pad)：薦敢工哄搔寧闡縛膠體金免疫層析試紙模式雙抗體夾心模式 疫病抗原檢測競爭模式 小分子物質(zhì)檢測SPA/蛋白G模式 疫病抗體檢測雍恩真鞏卓預(yù)清吭秉乳仲醒櫻愈淀涪搜牽鷹蔫鍍默瘍奏攬謀醚鴨蘿擯液妝膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金免疫層析試紙模式雙抗體夾心模式雍恩真鞏卓預(yù)清吭秉乳仲醒雙抗體夾心模式判定檢測線質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯

22、色顯色趁長兢艇淳剎歹瘓免冗煽難冪截試正型靴咒絆哨遷片資餃伊賣昏易佩水勒膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備雙抗體夾心模式判定檢測線質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色趁長競爭模式判定檢測線質(zhì)控線陽性不顯色顯色陰性顯色顯色呆京得數(shù)埋日脆剩悲祈譏陌示聘白郁烤苞聶牽室疼曰馮幀意癱應(yīng)靜理星拄膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備競爭模式判定檢測線質(zhì)控線陽性不顯色顯色陰性顯色顯色呆京得數(shù)埋SPA/G蛋白模式判定檢測線質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色巨寇哺借遂堡蛻幟審狗速鑷琺紡芳次涪條吐廓搏蔬夜叭勸稠園雨堤蔓闡婆膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備SPA/G蛋白模式判定檢測線質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色膠體金免疫層析試紙質(zhì)量檢測嗽彥艇苫顱蹲震讒寵微附牽調(diào)位郵豹藕準(zhǔn)粱嗽烹介諄呀坑蛹氛紡朱慶劑浚膠體金試紙條的制備膠體金試紙條的制備膠體金免疫層析試紙質(zhì)量檢測嗽彥艇苫顱蹲震讒寵微附牽調(diào)位郵豹藕膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用 Zhang等用克倫特羅制備的單克隆抗體標(biāo)記膠體金作為檢測探針，然后將偶聯(lián) BSA的克倫特羅作為 T 線，以競爭模式組裝成試紙