期末復(fù)習(xí)分子生物學(xué)九-pcr

1、2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用分子生物學(xué) 第9章 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是生命科學(xué)界的重大發(fā)明，是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。通過體外（試管內(nèi)）擴(kuò)增，可以將目的基因（或靶基因）片段百

2、萬(wàn)倍的放大，從而達(dá)到極大地提高核酸分子檢測(cè)的靈敏度，理論上其檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到一個(gè)細(xì)胞、甚至一個(gè)分子的水平。 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics3PCR發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的發(fā)明人，一般公認(rèn)是凱利穆利斯（K. Mullis, 在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR 。1983年4月穆利斯萌發(fā)了PCR的構(gòu)想;1985 關(guān)于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 發(fā) 表; 1987 當(dāng)年7月Cetus 公司在美國(guó)獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn),并于當(dāng)年11月推出了第一 個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循

3、環(huán)儀；1989 Science 報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶 Taq 酶的 發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來(lái)；1990 Cetus科學(xué)家 D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純 化Taq DNA 多聚酶的方法；1991 TaqMan 技 術(shù) 發(fā) 表；九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面展開；1998年 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國(guó)較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/9/12Zhejiang Provincial Key L

4、ab of Medical Genetics5Kary B. Mullis 1989年美國(guó)Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics6PCR的應(yīng)用研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測(cè)其他2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Gen

5、etics7PCR技術(shù)的基本原理是DNA的半保留復(fù)制，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在體內(nèi)，DNA復(fù)制是周期性的，所以基因擴(kuò)增的數(shù)量有限；PCR技術(shù)在體外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合適的底物和因子，通過對(duì)溫度的控制，使DNA不斷位于變性、復(fù)性和合成的循環(huán)中，達(dá)到擴(kuò)增DNA的目的。 2. PCR基本原理2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics8模板DNA94變性55退火72引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸圖6-1 PCR原理示意圖2022/9/12Zhejia

6、ng Provincial Key Lab of Medical Genetics91234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics10PCR產(chǎn)物生成曲線擴(kuò)增產(chǎn)物循環(huán)次數(shù)指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增平臺(tái)期2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics11PCR的特點(diǎn)

7、靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè) PFU (空斑形成單位)細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics12反應(yīng)體系： （五要素） 模板（template）引物(primer) 人工合成的兩段寡核苷酸序列，決定RCP的特異性。3. PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件DNA R

8、NA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、 病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics13PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)的頻率，特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無(wú)關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子；引發(fā)效率是指在每一PCR循環(huán)中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長(zhǎng)量的接近程度。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics14

9、引物的長(zhǎng)度 典型的引物為18-24個(gè)核苷酸，在一定范圍內(nèi)引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性；引物長(zhǎng)度的上限主要與反應(yīng)效率有關(guān)，所以一般又不能太長(zhǎng)，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于72，即Taq酶的最適溫度。引物設(shè)計(jì)基本原則2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics15PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度 一般來(lái)說(shuō)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率有影響。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在普通PCR以200500bp為宜；實(shí)時(shí)熒光PCR則為50150bp。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medic

10、al Genetics16引物的均衡性和GC含量 引物中堿基組成應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高(非特異性擴(kuò)增)或過低（特異性降低）都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics17引物溶解溫度（Tm值） 引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度. 如果引物中的G+C含量相對(duì)偏低,則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng),而保證一定的退火溫度. Tm=2(A+T)+4(C+G)2022/9

11、/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics18引物自身 引物間3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗; 引物3端的幾個(gè)堿基與模板DNA需嚴(yán)格配對(duì)，并最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)。 5端序列對(duì)PCR影響不如3端大，常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics19使用Primer Premier 5.0等軟件設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，點(diǎn)擊 按鈕，界面如下： 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of

12、Medical Genetics202022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics212022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics22- DNA 聚合酶(DNA polymerase) PCR發(fā)明初期，不耐熱的Klenow片段耐熱的Taq DNA聚合酶良好的熱穩(wěn)定性：92.5、95、97.5時(shí)，半衰期分別為130、40、56 min；良好的延伸效率：在7580 時(shí)延伸效率最高，每個(gè)酶蛋白分子的延伸速度可達(dá)150個(gè)核苷酸/s；無(wú)35外切酶活性，缺乏校正功能；202

13、2/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics23dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP- PCR buffer:一般組成：50mM KCl, 10-50mM, Tris-Cl (室溫PH8.3) ，1.5mM MgCl2 KCl：促進(jìn)引物退火，高濃度KCl抑制Taq DNA聚合酶活性；Tris-Cl：調(diào)節(jié)pH值，使反應(yīng)體系偏堿性；MgCl2 ：調(diào)節(jié)Taq DNA聚合酶活性、影響引物退火，PCR產(chǎn)物的特異性等2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics

14、241）PCR反應(yīng)成分（1）模板一般100ng DNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 PCR反應(yīng)條件2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics25（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus，水生棲熱菌) 0.5-5 U/100 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics26

15、（4）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics27（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。對(duì)于大多數(shù)的PCR引物來(lái)說(shuō)， Mg2+濃度為1.5mmol/L是適宜的，如果擴(kuò)增效果不好，則調(diào)整鎂離子的濃度可能會(huì)有所幫助。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等

16、的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics282）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 94, 30s1min。(2) 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定，一般比引物Tm值約低5。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性，但特異性低。熱啟動(dòng)：在第一輪擴(kuò)增前必須使模版DNA完全變性，一般94，變性5分鐘2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics29（3）延伸 70-75,一般為72 延伸時(shí)間由擴(kuò)

17、增片段長(zhǎng)度決定。（13 min)（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-30次 次數(shù)過多：產(chǎn)生“平臺(tái)效應(yīng)” 錯(cuò)誤摻入率增加2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics304.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法 、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP） 單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法 PCR產(chǎn)物測(cè)序 熒光PCR2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics31(一)瓊脂糖

18、凝膠電泳法基本原理：DNA在電泳緩沖液中帶負(fù)電荷，將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于負(fù)極端的加樣孔，在電場(chǎng)力的作用下DNA涌向正極，并且由于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，不同DNA分子量及構(gòu)型的DNA涌動(dòng)率不同；在電泳過程中，凝膠中的EB將嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復(fù)合物發(fā)出橙紅色熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比；不同濃度的凝膠分辨DNA的有效范圍不同。操作簡(jiǎn)單，但存在EB污染。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics32聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)及用途特點(diǎn)：分辨力高，長(zhǎng)度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；

19、回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics33(二)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶可識(shí)別特異DNA序列，所以用特定的限

20、制性核酸內(nèi)切酶對(duì)目的DNA分子進(jìn)行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應(yīng)出目的DNA分子的序列信息用途：傳染病病原體基因分型 人類基因的變異性研究。是診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型的常用方法2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics34PCR-RFLP法： 限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突變限制性內(nèi)切酶2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics35(三) 單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-Single Strand Conf

21、ormation Polymorphism，簡(jiǎn)稱PCR-SSCP）本法就是將PCR 產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA （ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics36PCR-SSCP過程 - primer - 32P-dNTP摻入 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物 變性 單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3

22、 4 5 自顯影 1.為正常 結(jié)果分析 2、4、5純合患者 3.為雜合子 . 解鏈構(gòu)像DAN原 理過 程2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics37優(yōu)點(diǎn)及作用：方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實(shí)驗(yàn)的需要。該方法和其他方法相比有較高的檢測(cè)率。首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DN

23、A片段。不足之處：只能作為一種突變檢測(cè)方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測(cè)序；電泳條件要求較嚴(yán)格；另外，由于SSCP是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時(shí)，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無(wú)法分辨造成漏檢。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics38(四) 核酸探針雜交法(1)點(diǎn)雜交（dot blot）(2)反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot）(3)微孔板夾心雜交（microplate

24、hybridization）(4)熒光探針雜交(5)Southern印跡雜交（Southern blot）2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics39樣品正對(duì)照負(fù)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)分子量 污染是PCR實(shí)驗(yàn)的常見問題。只要實(shí)驗(yàn)室里曾經(jīng)擴(kuò)增過某個(gè)片段，就有可能以后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生污染。因此，做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候絕對(duì)不要忘了負(fù)對(duì)照。用紫外燈破壞污染物也是一個(gè)辦法5. PCR常見問題及分析2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics40(1) 假陽(yáng)性PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。陽(yáng)性對(duì)照

25、的污染。標(biāo)本之間的交叉污染。在采集標(biāo)本時(shí)，其他污染源帶來(lái)的污染。使用帶有污染的試劑。預(yù)防措施：2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics41(2) 假陰性假陰性是PCR反應(yīng)中另一個(gè)易出現(xiàn)的問題。造成的原因也比較多?？梢詺w納以下幾方面原因。1)標(biāo)本處理的原因。 處理標(biāo)本時(shí)，靶DNA丟失。 處理標(biāo)本時(shí)，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。 標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics422)PCR

26、試劑問題。 引物設(shè)計(jì)不合理。 Taq DNA聚合酶失活。 Mg2+濃度過低或是沒有加。3)PCR擴(kuò)增過程中的問題 PCR擴(kuò)增儀故障。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。 4) PCR產(chǎn)物鑒定中的問題 電泳時(shí)沒有加溴化乙錠。 電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。 凝膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics43(3) 引物二聚體形成引物二聚體的原因有： 兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì)，特別是引物3端有互補(bǔ)區(qū)。 引物比例太高，可增加模板用量。 退火溫度過低。 熱循環(huán)次數(shù)過多。2022/9/12

27、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics44(4) 非特異性PCR產(chǎn)物造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預(yù)防措施： 引物特異性不高或用量太大，應(yīng)更換引物或降低用量；TaqDNA聚合酶質(zhì)量不好或用量太大，應(yīng)更換酶或降低酶使用量； Mg2+濃度過高，可適當(dāng)調(diào)整其濃度；退火溫度過低，可提高退火溫度；延伸時(shí)間過長(zhǎng)，可減少延伸時(shí)間；熱循環(huán)次數(shù)過多，應(yīng)適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics456. PCR技術(shù)的發(fā)展巢式PCR（nested PCR

28、）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplex PCR) 重組PCR( binant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不對(duì)稱PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 擴(kuò)增長(zhǎng)片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 原位PCR (in situ PCR)差示PCR（DD-PCR） 定量PCR 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics

29、46圖6-3 巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次 PCR第二次 PCR（一）巢式PCR （nested PCR ） 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics47提高反應(yīng)的特異性2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics48RNA 模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA 雜化雙鏈RNA酶單鏈cDNA聚合酶雙鏈cDNA（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）2022/9/12Zhejiang Prov

30、incial Key Lab of Medical Genetics49one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，稱為一步法RT-PCR。TthDNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄功能和DNA聚合功能。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42）和MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37），常用的逆轉(zhuǎn)錄引物有三種：隨機(jī)引物；Oligo（dT），只適合于3端帶有poly(A)尾的mRNA；特異性引物，只適合于逆轉(zhuǎn)錄目的RNA序列。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，再做PCR。2022/9/12Z

31、hejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics50經(jīng)濟(jì)2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics51（三）多重PCR（multiplex PCR） PCR一般由一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，以此手段診斷疾病的效率低。為提高效率，常采用多重PCR技術(shù)。該技術(shù)是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，由于每對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。2022/9/12Zhejiang Pr

32、ovincial Key Lab of Medical Genetics52用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics53乳頭瘤病毒（）檢驗(yàn)及分型 宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性中僅次于乳腺癌。我國(guó)每年有宮頸癌新發(fā)病例.萬(wàn)，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的.。臨床科學(xué)研究表明，持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的直接原因?？煞譃楦呶Ｐ秃偷臀Ｐ蛢煞N，不同的亞型在致癌性方面存在很大的差別。至今發(fā)現(xiàn)的病毒約有種，至少有種高危型會(huì)構(gòu)成子宮頸癌。所以提早診斷感染，對(duì)尤其是高危型進(jìn)行檢驗(yàn)和分型極為重要

33、。 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics54（四）重組PCR（ binant PCR）將兩個(gè)不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。該技術(shù)主要應(yīng)用于DNA片段的任何位置引入點(diǎn)突變、插入、缺失以及兩個(gè)不相鄰片段的連接。其基本原理是將突變堿基、插入或缺失片段、或一種物質(zhì)的幾個(gè)基因片段的部分堿基設(shè)計(jì)在引物中，先分段對(duì)模板擴(kuò)增，除去多余的引物后，將產(chǎn)物混合，再用一對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到的產(chǎn)物是一重組合的DNA。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical

34、Genetics55引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，變性和復(fù)性延伸異源部分雙鏈DNA形成5555533333333333555555PCR引物a引物d 再次 PCR5533（四）重組PCR（ binant PCR）2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics56（五）錨定PCR（anchored PCR，APCR） 用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA 例如，T細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因5端具有高度可變性。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics57（

35、六）不對(duì)稱PCR（asymmetric PCR）其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50100:1。在PCR最初10-15個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個(gè)循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時(shí)單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列的要求。2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics58已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切點(diǎn)（X）限制酶

36、切點(diǎn)（X）限制酶X酶切連接未知序列（七）反向PCR（inverse PCR）2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics59（八）定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR）以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。 定量PCR定量的理論依據(jù)：理想的擴(kuò)增結(jié) 果：Y=X2n 其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量， X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù) n為擴(kuò)增次數(shù)； 理 論

37、上PCR擴(kuò)增效率為 100%，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長(zhǎng)，但實(shí)際上：DNA的每一 次復(fù)制都不完全，即每一次擴(kuò)增中，模板不是呈 2 的倍增長(zhǎng)；實(shí)際應(yīng)為：Y= X(1+E)n ，其 中E 代表擴(kuò)增效率：E = 參與復(fù)制的模板/總模板，通常E1，E在整個(gè)PCR擴(kuò)增過程中不是 固定不變的。通常X 在 1105 拷貝、循環(huán)次數(shù)n30 時(shí)，E 相對(duì)穩(wěn)定，原始模板以相對(duì)固 定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics601PCR定量DNA 一個(gè)或兩個(gè)拷貝的特定靶序列的細(xì)胞株即是標(biāo)

38、準(zhǔn)的一個(gè)理想來(lái)源，也可使用含特定靶序列的質(zhì)粒DNA作為對(duì)照，將待檢樣品與一系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照一起擴(kuò)增，檢測(cè)PCR產(chǎn)物，即可推知靶序列的含量。2PCR定量mRNA (1)mRNA相對(duì)定量靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量與內(nèi)源性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物量的比值 (2)競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量mRNA (3)cRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量mRNA2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics61實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）與普通PCR的區(qū)別 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 對(duì)P

39、CR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一

40、個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析；無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)與普通PCR的區(qū)別普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量

41、和定性分析；無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics62如何對(duì)初始模板定量?熒光信號(hào)如何產(chǎn)生？Real time PCR 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics63實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical G

42、enetics64實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖： 橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度 每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics65實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -熒光閾值熒光信號(hào)閾值 （threshold ）： 前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值 熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 手動(dòng) 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入

43、指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99 真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics66實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -Ct值Ct值的定義： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) value 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics67實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則

44、極具重現(xiàn)性2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics68熒光定量PCR原理理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0 (1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率XCt=X0 (1+Ex)Ct =Nlog X0= - log(1+Ex) *Ct+ log NXCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù)最后結(jié)論：Log X0與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量2022/9/12Zhejiang Pr

45、ovincial Key Lab of Medical Genetics69 標(biāo)準(zhǔn)曲線（使用外參照物的定量PCR） 將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行Real time PCR，就會(huì)按照起始DNA濃度由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。再由Ct值與起始模版的對(duì)數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，就可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品與標(biāo)品一樣，也可得到Ct值，并將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模版量。 2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics70熒光信號(hào)如何產(chǎn)生？非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記：

46、2、TaqMan3、Molecular Beacon2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics71 SYBR Green ISYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光（ SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位）變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)。SYBR Green 也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics72SYBR-Green I5353

47、SGExcitationSGSGSGSGEmission雙鏈熒光染料 SYBR-Green I熒光染料原理示意圖2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics73SYBR-Green I5353SGSGSGSGSGExcitationEmission2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics74Real-Time PCR，SYBR greenCycle 1Cycle 3Cycle 2Molecular Probe公司的一個(gè)專利產(chǎn)品，US Patent5,436,134 1993年7月12日申請(qǐng)2022/9/12Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics75熒光強(qiáng)度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI游離Tm是熔解曲線的特征值：SYBR Green I 熔解曲線分析當(dāng)雙鏈DNA解鏈一半時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，此時(shí)的溫度為溶解溫度。Tm值與PCR產(chǎn)物序列有關(guān)，對(duì)某一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物其值是固定的。溶解曲線的一次曲線溶解曲線的負(fù)一次微分