負(fù)載MMP-2siRNA陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備及體外轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)

1、中國(guó)科技論文在線(xiàn)中國(guó)科技論文在線(xiàn)- FORMTEXT Preparation of cationic liposomes delivering MMP-2 siRNA and its transfection study of hepatic stellate cells in vitro FORMTEXT LIU Feng1, FORMTEXT CHEN Pingshen2(1. Department of Pathology and Pathophysiology, Medical School, Southeast University, Nanjing, 210009;2. Depar

2、tment of Pathology and Pathophysiology,Medical School,Southeast University, Nanjing, 210009)Abstract: FORMTEXT Objective: To explore the preparation method and characteristics of cationic liposomes delivering siRNA and evaluate its toxicity, transfection efficiency and gene silencing efficiency on h

3、epatic stellate cells. Methods: The cationic liposomes were prepared by film dispersion and high pressure homogenizer method. TEM, ZETA-SIZER were used to characterize cationic liposomes. Transfect HSC in vitro and evaluate its toxicity, transfection activity and gene silencing efficiency. Results:

4、The average diameter of cationic liposomes was about 133.9 nm and the average zeta potential was 41.67mV. Transfect HSC in vitro showed that it has low cytotoxicity, high transfection activity, and the three siRNA of gene silencing efficiency is50.6%、40.0%、53.4%. The mRNA expression and enzymatic ac

5、tivity of MMP-2 in HSC-T6 was significant declined after treated with MMP-2 siRNA. Conclusion: Cationic liposomes which have smaller particle size, good stability, low toxicity and high gene silencing efficiency can be successfully prepared by these methods. This study provides an effective tool to

6、siRNA interference experiments. Key words: FORMTEXT pathology; cationic liposomes；siRNA; hepatic stellate cells; matrix metalloproteinase-2; transfection activity引言RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由siRNA或miRNA引起其同源mRNA特異性降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。與其他抑制基因表達(dá)的方法相比，siRNA技術(shù)具有特異、高效和持久等特點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單相對(duì)安全，所以其研究和應(yīng)用現(xiàn)已成為基因治療研究的

7、熱點(diǎn)，同時(shí)該技術(shù)也為一些臨床疾病的基因治療開(kāi)辟了一條新途徑。然而，目前運(yùn)輸siRNA的載體并不完善，普遍存在轉(zhuǎn)染效率低、毒性大等問(wèn)題。其中陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為一種非病毒載體，具有無(wú)免疫原性、可自然降解等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受研究者關(guān)注。但是，陽(yáng)離子脂質(zhì)體在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染方面仍存在許多問(wèn)題，如在不同細(xì)胞、不同結(jié)構(gòu)配比下轉(zhuǎn)染效率不同等。HSC細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，肝內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）主要由HSCs產(chǎn)生，MMP-2對(duì)該細(xì)胞活化起促進(jìn)作用，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)中都起重要作用，在肝纖維化發(fā)展的不同時(shí)期，干預(yù)MMP-2的表達(dá)

8、，對(duì)肝纖維化的治療具有重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)中，我們成功制備了陽(yáng)離子脂質(zhì)體，對(duì)其體外理化性質(zhì)進(jìn)行了考察，并評(píng)價(jià)了負(fù)載MMP-2 siRNA后其對(duì)HSC的細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率及基因沉默效率，為后續(xù)HSC細(xì)胞的RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究提供可靠參考。1 材料與方法1.1 試劑和儀器膽固醇 (北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)，3-N-( N,N-二甲基胺乙基)胺基甲?；懝檀?3-N-( N,N- dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol, Sigma, 美國(guó))，二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho

9、ethanolamine, DOPE, Sigma, 美國(guó)), MMP-2-siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，其余均為化學(xué)純。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (河南鞏義英裕子華儀器廠(chǎng))，超聲波清洗器 (上海超聲波儀器廠(chǎng)) H2600透射電子顯微鏡 (Hitachi, 日本)，ZETA SIZER 3000 激 光 粒 度 分 析 儀(MALVERN, 英國(guó))，高壓均質(zhì)機(jī) (Avestin, 加拿大)，熒光顯微鏡（Nikon, 日本）。肝星狀細(xì)胞株HSC-T6（大鼠源性）為本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備 將DC-Chol、DOPE、膽固醇按摩爾比4:3:3混合置于圓底燒瓶，加入適量

10、氯仿-甲醇（3:2, v/v）溶液水浴超聲振蕩5min，使其中物質(zhì)充分溶解混勻，37水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，使脂材在瓶壁上形成一層均勻薄膜；加20ml pH 7.2的1PBS緩沖液，高速攪拌30min，待薄膜完全脫落后探頭超聲1min，經(jīng)220m濾膜反復(fù)擠壓34次，41.2.2 陽(yáng)離子脂質(zhì)體的表征 將制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體懸液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，滴有膜銅網(wǎng)，觀(guān)察其外觀(guān)形態(tài)。用 ZETA SIZER 3000激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑測(cè)定，應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，記錄平均粒徑、多分散性指數(shù)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察：將陽(yáng)離子脂質(zhì)體在4靜置兩個(gè)月后，1.2.3 MMP-2 siRNA設(shè)計(jì) 從Genba

11、nk中選取大鼠MMP-2 mRNA序列，采用siRNA Target Designer- Version 1.51設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3對(duì)MMP-2 siRNA及1對(duì)陰性對(duì)照序列，序列見(jiàn)表1。表1 MMP-2特異性siRNA序列及陰性對(duì)照序列Tab. 1 MMP-2 specific siRNA sequence and negative control siRNA sequence序列名稱(chēng)序列（5-3）靶位點(diǎn)MMP-2-rat-608sense strand GUGGCCAACUACAACUUCUTTantisense strand AGAAGUUGUAGUUGGCCACTT608-628MMP-2

12、-rat-2061sense strand GGAGAUACAAUGAAGUAAATTantisense strand UUUACUUCAUUGUAUCUCCTT2061-2081MMP-2-rat-2171sense strand GGUGGUCACAGCUAUUUCUTTantisense strand AGAAAUAGCUGUGACCACCTT2171-2191Negative controlsense strand UUCUCCGAACGUGUCACGUTTantisense strand ACGUGACACGUUCGGAGAATT1.2.4 陽(yáng)離子脂質(zhì)體siRNA結(jié)合能力檢測(cè) 將陽(yáng)離

13、子脂質(zhì)體與siRNA分別按0：1、1：1、3：1、5：1、7：1、9：1、15：1的質(zhì)量比結(jié)合（終體積50L，其中siRNA的濃度恒定為0.01g/L），室溫混勻后靜置30min，以便充分反應(yīng)形成復(fù)合物。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)陽(yáng)離子脂質(zhì)體siRNA結(jié)合情況。1.2.5 陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物細(xì)胞毒性的考察 采用MTT比色法測(cè)定陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)HSC-T6細(xì)胞的毒性。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，以5103/孔接種于96孔板，在37、5%CO2條件下培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)組每孔中分別加入不同質(zhì)量比的陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物（siRNA恒定為濃度為30mM）和Opti-MEM培養(yǎng)液共20

14、0L，陰性對(duì)照組加入opti-MEM培養(yǎng)液，用Lipofectamine 2000作為陽(yáng)性對(duì)照組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37、5%CO細(xì)胞存活率=A試驗(yàn)孔/A對(duì)照孔100%1.2.6 陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率分析 HSC-T6以3105/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約為50% 60%時(shí)，棄上清，向各個(gè)孔中加入不同質(zhì)量比的陽(yáng)離子脂質(zhì)體-FAM-siRNA復(fù)合物（siRNA恒定濃度為30mM）混懸液0.2mL及opti-MEM培養(yǎng)液1.8mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用Lipofectamine 2000加FAM-siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照則用裸露FAM-siRNA直接進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6h

15、后熒光顯微鏡觀(guān)察其轉(zhuǎn)染效率。1.2.7 基因沉默效率實(shí)驗(yàn) 將陽(yáng)離子脂質(zhì)體與MMP-2-siRNA按質(zhì)量比5:1混勻（siRNA濃度30nM），體外轉(zhuǎn)染HSC-T6，36h后提取總RNA，檢測(cè)MMP-2 mRNA表達(dá)。MMP-2引物1：正義鏈為5- CATCGTACTCCTCGTTGCTGATCCACAT-3，反義鏈為5-CTCCCTCATGCCATCCTG CGTCTG-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為228 bp。內(nèi)參GAPDH引物2：正義鏈為5- GAAGGGCTCATGACCACAGT-3，反義鏈為5-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為117 bp。MM-2擴(kuò)增反應(yīng)條件：94

16、5 min，9430 s，62.530 s，721.2.8 siRNA靶向干擾不同時(shí)間對(duì)MMP-2 mRNA表達(dá)及MMP-2酶活性的影響 陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹MMP-2 siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6，6h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，分別在12h、24h、36h、48h、72h收獲細(xì)胞并收集上清，提取RNA，RT-RCR檢測(cè)MMP-2 mRNA表達(dá)情況，上清用超濾管濃縮并蛋白定量后，做明膠酶譜檢查。各時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的同條件培養(yǎng)作為對(duì)照組。1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用xs表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 陽(yáng)離子

17、脂質(zhì)體形態(tài) 本法制備的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體為白色乳狀液，略帶藍(lán)色乳光。透射電鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體分散性良好，大部分為單室脂質(zhì)體，近似球形，粒徑分布范圍在100200nm間（圖1）。4圖 1 空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體電鏡圖片F(xiàn)ig. 1 Shape of cationic liposomes observed by TEM2.2 陽(yáng)離子脂質(zhì)體粒徑及zeta電位測(cè)定ZETA SIZER 3000激光粒度分析儀測(cè)定結(jié)果顯示：陽(yáng)離子脂質(zhì)體平均粒徑在133.9 nm左右，單峰狀，多分散指數(shù)為0.167，粒徑分布范圍窄，分布均勻（圖2）。其平均zeta電位為41.67mV，脂質(zhì)體帶正電荷，具有較好的穩(wěn)定性。圖2

18、 陽(yáng)離子脂質(zhì)體激光粒度分析儀結(jié)果Fig. 2 ZETA SIZER result of cationic liposomes2.3 陽(yáng)離子脂質(zhì)體siRNA結(jié)合能力 瓊脂糖凝膠電泳顯示，隨著陽(yáng)離子脂質(zhì)體量的增加，其siRNA包裹能力增強(qiáng)，從5:1開(kāi)始，陽(yáng)離子脂質(zhì)體便能將siRNA完全包裹（圖3）。1 DC-Chol/ siRNA=1:0，2 DC-Chol/ siRNA=1:1，3 DC-Chol/ siRNA=3:1，4 DC-Chol/ siRNA=5:1，5 DC-Chol/ siRNA=7:1，6 DC-Chol/ siRNA=9:1，2 DC-Chol/ siRNA=15:1圖3 不同

19、質(zhì)量比的陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)Fig. 3 Electrophoretic results of compound of liposome with siRNA in different proportions2.4陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性 陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物對(duì)HSC-T6存在一定的毒性，但不十分明顯，且陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性與DC-Chol濃度成正比，當(dāng)DC-Chol/ siRNA高達(dá)20:1時(shí)，細(xì)胞存活率仍在80%（圖4）。圖4 不同DC-Chol/siRNA對(duì)HSC的細(xì)胞毒性Fig. 4 Toxicity of liposomes to H

20、SC cells with different DC-Chol concentrations2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以商品化的轉(zhuǎn)染試劑和裸露siRNA直接轉(zhuǎn)染作為對(duì)照，評(píng)價(jià)了陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在HSC-T6細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)染效率。裸露siRNA直接轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中觀(guān)察不到綠色熒光，不同比例陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA混合物對(duì)HSC-T6細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6h后熒光顯微鏡下均觀(guān)察到細(xì)胞胞體內(nèi)有綠色熒光（圖5)，其中當(dāng)DC-Chol/ siRNA=5時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染效率為72.4%，高于和低于此比例轉(zhuǎn)染效率均低于5:1組，且隨著質(zhì)量比升高細(xì)胞毒性也隨之升高。A：Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染組

21、B：DC-Chol/ siRNA=5轉(zhuǎn)染組 C：裸露siRNA轉(zhuǎn)染組圖5 熒光顯微鏡下HSC-T6轉(zhuǎn)染效率的觀(guān)察Fig. 5 Transfection efficiency observed by fluorescence microscope2.6 基因沉默效率轉(zhuǎn)染36h后，各組MMP-2相對(duì)于內(nèi)參的灰度比值分別為1.310.05、1.270.08、0.640.03、0.780.05、0.610.03，各干擾組與空白對(duì)照組之間mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），且3組siRNA干擾效率分別是50.6%、40.0%、53.4%（圖6）。圖6 轉(zhuǎn)染36h后HSC-T6 MMP-2 mRN

22、A表達(dá)變化Fig. 6 MMP-2 mRNA expression changes after 36h transfection2.7 siRNA靶向干擾不同時(shí)間對(duì)MMP-2 mRNA表達(dá)及MMP-2酶活性的影響MMP-2 siRNA靶向干擾不同時(shí)間后，MMP-2 mRNA表達(dá)情況如圖7所示：轉(zhuǎn)染12h后目的基因表達(dá)沒(méi)有明顯變化，從24h后表達(dá)下調(diào)，在干擾48h后目的基因表達(dá)量降到最低，而后表達(dá)上調(diào)。明膠酶譜檢測(cè)干擾前后MMP-2蛋白酶活性變化，結(jié)果顯示，MMP-2 siRNA靶向干擾后，酶活性顯著下降（P0.05），且在干擾48h后酶活性降到最低，與RT-PCR結(jié)果相符（圖8）。A正常對(duì)照組

23、不同時(shí)間MMP-2 mRNA RT-PCR電泳圖； B干擾不同時(shí)間后MMP-2 mRNA RT-PCR電泳圖圖7 轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后 MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 MMP-2 mRNA expression changes after different transfection time圖8 轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后MMP-2活性變化Fig. 8 MMP-2 enzymatic activity changes after different transfection time3 討論陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由陽(yáng)離子脂質(zhì)和中性磷脂組成，兩種成分結(jié)合可形成穩(wěn)定的雙層膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)可降低陽(yáng)離子脂質(zhì)的毒性。

24、DOPE是目前應(yīng)用最廣泛的中性磷脂，具有很強(qiáng)的細(xì)胞去穩(wěn)定化作用，誘導(dǎo)脂質(zhì)體膜與體內(nèi)膜融合，從而快速釋放外源基因3。目前文獻(xiàn)上報(bào)道的陽(yáng)離子脂質(zhì)體多由DOTAP或DC-Chol與DOPE按一定比例制備而成，本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)離子脂質(zhì)體由DC-Chol、DOPE、膽固醇按比例制成，膽固醇加入陽(yáng)離子脂質(zhì)體雙層中，可生成極具活力的復(fù)合物，除能抵抗血清的抑制作用外，還可以借助于改善細(xì)胞與復(fù)合物的結(jié)合和攝取，顯著提高轉(zhuǎn)染效率4。超聲可以使脂質(zhì)體粒徑變小，將大多室脂質(zhì)體變?yōu)樾问抑|(zhì)體，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中，將形成的薄膜高速攪拌水化之后，間歇式探頭超聲1min，制成的脂質(zhì)體粒徑均在200nm以下，且粒徑分布范圍窄，分散均勻。

25、zeta電位的大小影響脂質(zhì)體混懸液的穩(wěn)定性，帶電脂質(zhì)體能夠減少相互間的聚集和融合，增加穩(wěn)定性，當(dāng)zeta電位絕對(duì)值小于30 mV時(shí)，荷電粒子不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚集5。本實(shí)驗(yàn)制備的脂質(zhì)體的zeta電位為41.67mV，因此比較穩(wěn)定，4陽(yáng)離子脂質(zhì)體與核酸的比例是影響基因轉(zhuǎn)染效率的重要因素之一。siRNA在體外很不穩(wěn)定易受核酸酶的降解，陽(yáng)離子脂質(zhì)體可通過(guò)靜電作用與之結(jié)合，形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物，將siRNA壓縮包進(jìn)脂質(zhì)體囊泡中，從而利于被細(xì)胞攝取并免于被核酸酶降解。本研究結(jié)果顯示當(dāng)DC-Chol/ siRNA大于5:1時(shí)，siRNA被陽(yáng)離子脂質(zhì)體完全包裹。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果表明當(dāng)DC-Cho

26、l/ siRNA等于5時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，用此比例轉(zhuǎn)染時(shí)基因沉默效率均在50%左右。siRNA干擾不同時(shí)間后，MMP-2基因表達(dá)及酶活性均顯著降低，且在干擾48h時(shí)，基因表達(dá)量及酶活性降到最低。陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為外源基因的載體，具有制備簡(jiǎn)單、毒性低、無(wú)免疫原性、轉(zhuǎn)移的核酸大小范圍廣（從寡核苷酸到染色體均可）、可被機(jī)體降解等優(yōu)點(diǎn)，因此成為目前基因治療應(yīng)用最廣泛的非病毒類(lèi)載體之一6。雖然陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有明顯的基因轉(zhuǎn)染功能，但也存在很多不確定性，如在不同細(xì)胞、不同轉(zhuǎn)染時(shí)間、不同結(jié)構(gòu)及比例等情況下，轉(zhuǎn)染效率不同，說(shuō)明陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染受多方面因素影響7。因此需要對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備、基因轉(zhuǎn)染等條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得最佳結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)制備了負(fù)載MMP-2 siRNA陽(yáng)離子脂質(zhì)體，制備方法簡(jiǎn)單，粒徑均一，在保證轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，對(duì)HSC-T6細(xì)胞毒性較小，為以后的MMP-2 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)研究提供了一個(gè)有效的工具。參考文獻(xiàn) (References) FORMTEXT 1 李靜, 陳平圣. 缺氧肝細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)及活性水平的影響J.東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2010,29(3):272-2752 Jing Li, Renhua Fan, Susu