microRNA 過(guò)表達(dá)載體具體步驟及說(shuō)明

1、microRNA過(guò)表達(dá)載體具體使用說(shuō)明及步驟MicroRNA ( miRNA )是一類(lèi)真核生物內(nèi)源性 的小分子單鏈RNA，通常長(zhǎng)為1825nt，能夠通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基配對(duì)結(jié)合，引起靶序列降解或抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào) 控(如右圖所示)。 GenePharmaMicroRNA 載體 利用 CMV 啟動(dòng)子可以在眾多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中快速、 高效、持 續(xù)表達(dá)pre-miRNA /經(jīng)過(guò)Drosha( RNase 口)乍用形成 small hairpin pre-miRNAs。在使用載體法針對(duì)某一 MicroRNA 進(jìn)行過(guò)表達(dá)研究過(guò)程中，通常會(huì)遇到 如下幾個(gè)問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的確立、

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定、基因表 達(dá)效率的檢 測(cè)。1、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的確立 在一個(gè)完善的 MicroRNA 表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，必須 考慮設(shè)立正確合理的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。通常，這些對(duì)照組包括載體陰性對(duì) 照組、轉(zhuǎn)染試劑 對(duì)照組。 載體陰性對(duì)照可以有兩種，一種是采用通 用 的 陰性對(duì)照組， 在本試劑盒中包括了該對(duì)照所需的 載體(microRNA ),可以表達(dá)與目的基因序列無(wú)同源性的microRNA片 段；另一種是將目的 microRNA 的序列打亂后重新組合所得的陰性 對(duì)照( scrambled)。 對(duì)照組的設(shè)立對(duì)于 MicroRNA 表達(dá)研究是很有 必要的，您可以利用載體對(duì)照來(lái)確認(rèn) microRNA 實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染、

3、RNA 提取和基因表達(dá)檢 測(cè)方法的可靠性。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定使用 MicroRNA 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，為了選擇合適的轉(zhuǎn)染方法和確定 轉(zhuǎn)染效率，通常采用報(bào)告基因來(lái)檢測(cè) DNA 的導(dǎo)入情況。最常用的 報(bào) 告基因是綠色熒光蛋白。3、 MicroRNA 表達(dá)的檢測(cè) 通常用兩大類(lèi)方法來(lái)檢測(cè) MicroRNA 表達(dá) 效率，一類(lèi)方法是直接檢測(cè) MicroRNA 的變化水平，常用的方法如 northern雜交、芯片（microarrays ）以及核糖核酸酶保護(hù)分析，但這 些傳統(tǒng)的方法都需要用到標(biāo)記探針與純化的 RNA 進(jìn)行雜交，由于成 熟的 miRNAs 及其前 體共享一段共同的靶序列，而且目前的這些方 法

4、有無(wú)法通過(guò)大小將其分開(kāi)，因此很難專(zhuān)一識(shí)別成熟的 MicroRNA， 導(dǎo)致較高的背景信號(hào)。另一類(lèi)方法是通過(guò)檢測(cè)目的基因的生物學(xué)效應(yīng) 和細(xì)胞效應(yīng)來(lái)間接的反映目的基因的表達(dá)變化，這一類(lèi)方 法很多， 不同的基因有不同的檢測(cè)方法。通常選用直接檢測(cè) MicroRNA 的變 化情況，可以很直觀地反映基因的真實(shí)情況，不過(guò)也有一部分 研究 人員通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞效應(yīng)如細(xì)胞增殖速率等指標(biāo)間接反映基因變化。 轉(zhuǎn)染條件的確定轉(zhuǎn)染前一天，接種0.4-13105細(xì)胞/孔至24孑L板中，加入500卩1含 血清培養(yǎng)液，37C 5% CO2培養(yǎng)至40-70%融合。 在50卩1 Opti-MEM I培養(yǎng)液或其它無(wú)血清培養(yǎng)液中加入0.5

5、-0.8yg DNA，混勻。使用前輕輕混勻RNAi-Mate試劑，切忌離心處理。用30卩1無(wú)血清的DMEM或Opti-MEM ,或其他無(wú)血清培養(yǎng)基）稀釋1-4pg RNAi- Mate 試劑（可以分別設(shè)立 DNA/RNAi-Mate 的不同用 量組，通常 DNA 和 RNAi-Mate 的用量在 1：2-1：5 范圍內(nèi)，針對(duì)不同的細(xì)胞 需要不同的用量）， 輕輕混勻，室溫放置 5 分鐘。將稀釋好的DNA和RNAi-Mate試劑混合，定容到100卩1 ；輕柔混 勻，室溫放置 30 分鐘， 以便形成 DNA-Mate 復(fù)合物。將100卩1 DNA/RNAi-Mate復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板

6、 的孔中，來(lái)回輕柔搖晃 細(xì)胞培養(yǎng)板板，使 DNA/RNAi-Mate 混合物 均勻覆蓋細(xì)胞。細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37口溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢 測(cè)步驟。如果細(xì)胞株比 較敏感，孵育 4-6 小時(shí)后，除去復(fù)合物，更 換培養(yǎng)基。通過(guò)表達(dá)綠色熒光蛋白的 DNA 載體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后 24-48 h 后，使 用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白的 細(xì)胞，在明場(chǎng)觀察計(jì)數(shù)同一視野中的總細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn) 染細(xì)胞率=熒光蛋 白表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)TOO%?；蚴褂肈API等染料染核后，吏用流 式細(xì)胞 儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。如果在轉(zhuǎn)染條件摸索實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有找到較高效率的轉(zhuǎn)染方法，請(qǐng)更

7、換 轉(zhuǎn)染方法和試劑。如 無(wú)其他方法選擇，可以使用流式細(xì)胞儀將轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞分選出來(lái)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果無(wú)法分選細(xì) 胞，可以在計(jì)算 RNA 干擾抑制效率時(shí)去除轉(zhuǎn)染效率的影響，也可以使用抗生素對(duì)轉(zhuǎn)染后的 細(xì) 胞進(jìn)行初篩后再進(jìn)一步檢測(cè)抑制效率。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染設(shè)定合理的實(shí)驗(yàn)組/包括轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照(mock transfection)、陰性 對(duì)照(negative control)和目的基因?qū)嶒?yàn)組。按照前面實(shí)驗(yàn)確定的細(xì)胞接種量接種。37C 5% CO2培養(yǎng)至40- 70%融合。按照前面實(shí)驗(yàn)確定的轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如果需要轉(zhuǎn)染不同培養(yǎng)量的細(xì)胞，試劑的用量可 以根據(jù)相關(guān)參考進(jìn)行相應(yīng)的變化。轉(zhuǎn)染后 24-48h 后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步的檢測(cè)工作。通常，目的 基因在轉(zhuǎn)染后 24-48h 內(nèi) 就會(huì)表現(xiàn)出現(xiàn)表達(dá)，但有一些蛋白比如 穩(wěn)定性較強(qiáng)、半衰期較長(zhǎng)的蛋白在轉(zhuǎn)染后含量降低比較 緩慢，所 以需要延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間。穩(wěn)定細(xì)胞系建立前一天，準(zhǔn)備健康細(xì)胞，密度在 20%-40%。MicroRNA 表達(dá)載體和對(duì)照，按照轉(zhuǎn)染試劑推薦要求，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6 小 時(shí)后換成新鮮 培養(yǎng)液，培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，胰酶消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入較大的培養(yǎng)瓶中(如 6 孔板轉(zhuǎn)到 10cm plat