諾如病毒2016年培訓(xùn).課件

1、諾如病毒感染性腹瀉病 一、流行病學(xué) 諾如病毒感染性腹瀉是由諾如病毒屬病毒引起的急性胃腸道感染，具有發(fā)病急、傳播速度快、涉及范圍廣等特點(diǎn)，臨床上常稱為“冬季嘔吐病”，諾如病毒是引起非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)的主要病因。 1、流行形勢 20世紀(jì)70、80年代世界上發(fā)生的非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)中19%42%系NVs所致。在美國流行更加嚴(yán)重，19761981 年美國成人非細(xì)菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行中有 42%是由NVs引起的。1996年1月1997年6月美國疾病預(yù)防控制中心收到的90起非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)中，96%是NVs引發(fā)。據(jù)歐洲食源性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)對丹麥、英國、威爾士、芬蘭、德國、匈牙利、斯洛文尼亞、西班牙、瑞典、荷蘭等

2、國監(jiān)測結(jié)果顯示，1995-2000年85%以上的暴發(fā)性胃腸炎系NVs所致。2000-2005年挪威310次胃腸炎暴發(fā)中，204次與NVs有關(guān)。2006年，諾如病毒在全球引起腹瀉暴發(fā)流行，據(jù)歐洲、澳大利亞及北美地區(qū)食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)顯示，這些地區(qū)報(bào)道的諾如病毒胃腸炎疫情流行程度都顯著超過往年。 疫情迅速蔓延到日本，使日本發(fā)生了25年來最嚴(yán)重的一次由諾如病毒引起的急性胃腸炎疫情。日本國立傳染病研究所傳染病情報(bào)中心在約3000家醫(yī)療機(jī)構(gòu)調(diào)查了諾如病毒胃腸炎患者，統(tǒng)計(jì)分析顯示，從9月1日至12月10日，上報(bào)的患者人數(shù)累計(jì)達(dá)35.76萬人。據(jù)推算，全國至少已有近304萬人感染，數(shù)人死亡。其中195萬名患

3、者是在12月10日為止的一個月時間內(nèi)發(fā)病的。日本此次疫情檢測出的諾如病毒大部分屬于“G4”基因型。其他地區(qū)發(fā)生的相關(guān)群體事件：10月10日，新加坡丹福小學(xué)有41名學(xué)生因出現(xiàn)嘔吐或腹瀉的病狀而缺課，使過去一個多星期來發(fā)生在這所小學(xué)的病人數(shù)增至約290人。學(xué)生及教職員集體出現(xiàn)嘔吐及腹瀉癥狀的有四所中小學(xué)，病倒的總師生人數(shù)超過540人。新加坡衛(wèi)生部已經(jīng)證實(shí)這些中小學(xué)師生是患上諾如病毒所導(dǎo)致的胃腸炎或胃腸感冒。11月14日，一艘由意大利首都羅馬開往美國弗羅里達(dá)州的“自由號”超級郵輪上，有700多名乘客出現(xiàn)了胃部不適、嘔吐、發(fā)燒、腹瀉等癥狀。美國疾病控制預(yù)防中心已證實(shí)這些乘客感染了諾如病毒。 1995年

4、方肇寅等首次在我國河南省腹瀉患兒糞便中檢測到諾如病毒起，陸續(xù)對山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州等地區(qū)NVs感染暴發(fā)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果證明NVs感染在我國是普遍存在的。2、流行特征傳染源 ：病人、隱性感染者 傳播途徑：糞口途徑為主食用諾如病毒污染的食物或飲用諾如病毒污染的飲料； 接觸諾如病毒污染的物體或表面，然后手接觸到口； 直接接觸到感染者(如照顧病人，與病人同餐或使用相同的餐具)。易感人群：普遍易感，主要是成人和學(xué)齡兒童 諾如病毒胃腸炎多在寒冷季節(jié)發(fā)生暴發(fā)，但在其他季節(jié)也可出現(xiàn)小暴發(fā)。暴發(fā)中涉及的食物廣泛，以貝類、沙拉、三明治、蛋糕、冰霜、冰塊、飲水和木莓等直接食用品為主，其中貝類很可能來自污

5、染水域，在貝類生物體內(nèi)累積，木莓也因污水澆灌而遭污染。 二、病原學(xué)1、分類諾瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人類杯狀病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中諾如病毒（Norovirus,NVs）屬的原型代表株。諾如病毒是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。諾瓦克病毒最早是從1968年在美國俄亥俄州諾瓦克鎮(zhèn)一所小學(xué)暴發(fā)的急性腹瀉的患者糞便中分離的病原。1972年美國學(xué)者Kapikian等首先用免疫電鏡技術(shù)從1968年暴發(fā)的胃腸炎患者樣本中檢出了病原定名為諾瓦克病毒。此后，世界各地陸續(xù)自胃腸炎患者糞便中分離出多種形態(tài)與之相似但抗原性略異的病毒樣顆粒，均以發(fā)現(xiàn)地

6、點(diǎn)命名。先是稱為小圓結(jié)構(gòu)病毒，后稱為諾瓦克樣病毒（Norwalk-like virus,NLV）。2002年8月第八屆國際病毒命名委員會批準(zhǔn)名稱為諾如病毒（Norovirus,NVs）。諾如病毒與在日本發(fā)現(xiàn)的札幌樣病毒（Sapporo-like Virus，SLV）現(xiàn)在的正式名稱為札如病毒(Sapovirus,SVs)，合稱為人類杯狀病毒。 諾如病毒基因變異大，分型復(fù)雜，除基因組GI、GII共計(jì)31個基因型外，在RdRp和衣殼蛋白基因的重疊部位還可發(fā)生重組。由于重組NV的出現(xiàn)，使基因分型變得更為復(fù)雜。即使在同一群內(nèi)，由于個別堿基的變異，還可細(xì)分為不同的亞群/亞型，這些亞群/亞型的交替出現(xiàn)也可導(dǎo)

7、致疾病流行情況的改變 。3、培養(yǎng)特性不能在細(xì)胞或組織中培養(yǎng)無合適的動物模型4、理化特性諾如病毒對熱、乙醚和酸穩(wěn)定，室溫pH2.7環(huán)境下存活3h，20%乙醚4處理存活18h，60孵育30min仍有感染性，也耐受普通飲水中3.756.25ppm的Cl-濃度(游離氯0.51.0ppm)，室溫下在受污染的水、食物或環(huán)境中可存活一天至數(shù)天，容易造成大規(guī)模的集體感染事件。但在處理污水的10ppm的Cl-濃度中被滅活。 5、宿主范圍以前認(rèn)為人是唯一宿主，但近來在豬、牛等動物的糞便中也檢測到該病毒。有很多關(guān)于食用雙殼貝類引起暴發(fā)的報(bào)道，但它們并不是宿主，只是寄生，具有富集海水中病毒的作用。 6、致病性諾如病毒

8、致病力極強(qiáng)，感染劑量低，100個病毒顆粒即可導(dǎo)致發(fā)病。小腸壁被病毒感染后，小腸近端的絨毛變寬、變平，還可見單核細(xì)胞浸潤、核胞漿內(nèi)空泡形成。NVs引起腹瀉的原因是一些短暫性的糖類與脂肪吸收不良以及一些與吸收有關(guān)的酵素活性減低。 7、免疫性 人群感染后產(chǎn)生的免疫力有兩種類型：短期免疫和長期免疫。 短期免疫表現(xiàn)為型特異性，即發(fā)病6-14周后，對同株病毒的再攻擊有免疫力；但若用異性病毒攻擊，仍可發(fā)病。約半數(shù)病人患病后可獲得這種短期對同株病毒的免疫力，因此認(rèn)為短期免疫與抗體水平有關(guān)。長期免疫則與基因決定的腸道病毒受體差異有關(guān)?？偟恼f來，血清中諾如病毒抗體沒有明顯的保護(hù)作用，尤其是無長期免疫作用，所以極易

9、出現(xiàn)反復(fù)感染。 2、診斷臨床診斷病例：主要依據(jù)流行季節(jié)、地區(qū)、發(fā)病年齡等流行病學(xué)資料、臨床表現(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測結(jié)果進(jìn)行診斷。在一次腹瀉流行中符合以下標(biāo)準(zhǔn)者,可初步診斷為諾如病毒感染：（1）潛伏期2448h；（2）50%以上發(fā)生嘔吐；（3）病程1260h；（4）糞便、血常規(guī)檢查無特殊發(fā)現(xiàn)；（5）排除常見細(xì)菌、寄生蟲及其它病原感染。確診病例：除符合臨床診斷病例條件外，在糞便標(biāo)本或嘔吐物中檢測出諾如病毒。 四、實(shí)驗(yàn)室檢測諾如病毒的檢測方法多種多樣，早期主要用電鏡和免疫電鏡，隨著技術(shù)的發(fā)展，建立了分子生物學(xué)檢測方法和免疫學(xué)檢測方法。 1、標(biāo)本采集、運(yùn)送與保存糞便標(biāo)本應(yīng)在發(fā)病首日采集，最佳采樣時期不要

10、超過急性期(4872h)，此時為稀、軟便，糞便中的病毒含量最多；成形便和肛拭子其病毒含量較少。每份標(biāo)本量約10ml50ml，標(biāo)本置4不超過3天，近期不能檢測，應(yīng)直接在-20以下，最好-70以下長期貯存，并避免反復(fù)凍融。嘔吐物是糞便標(biāo)本的最佳補(bǔ)充，有助于病原的診斷，標(biāo)本的采集、儲存和運(yùn)送條件同于糞便。從流行病學(xué)角度出發(fā)，在水、食物或其它外環(huán)境標(biāo)本中檢出NVs意義重要。若是飲用水，需用大容量(5L100L)濃集病毒后檢測。樣品采集后最好在2h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。 2、標(biāo)本處理 糞便中成分復(fù)雜，對試驗(yàn)影響較大，需對標(biāo)本進(jìn)行處理。一般制成10%便懸液，進(jìn)行檢測或置-20冰箱保存?zhèn)溆谩?3、實(shí)驗(yàn)室檢查電鏡和免疫電鏡

11、法：電鏡檢測具有直接、可靠的優(yōu)點(diǎn)，對于檢測新出現(xiàn)的基因型的病毒具有其它方法不可替代的優(yōu)越性，但觀察的靈敏度較低，設(shè)備昂貴，技術(shù)條件要求高，不適于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。與普通電鏡法相比，免疫電鏡采用恢復(fù)期患者血清濃縮糞便中的病毒，比電鏡法的敏感性可提高 100 倍，從而增加檢出率。 免疫法 包括放射免疫法(RIA)、生物素-親和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。RIA法的靈敏度比IEM 法可提高10100倍，可以檢測出抗體升高的水平，為流行病學(xué)提供更有參考價值的資料。RIA 法的不足之處在于它需要 6 d，且需要放射性同位素標(biāo)記。為了簡化方法，

12、美國疾病預(yù)防控制中心建立了生物素-親和素免疫法，其靈敏度與 RIA 法相當(dāng)，目前該方法已成為美國疾病預(yù)防控制中心檢測NLV抗原和抗體的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法之一。分子生物學(xué)檢測方法由于諾如病毒基因變異性很大，ORP1的基因較ORP2的基因保守性略高，因此檢測所用的引物多來自O(shè)RP1，主要在RNA多聚酶區(qū)域，但即使這樣也沒有一對引物能檢測出所有型的病毒，但這些引物對目前引起暴發(fā)的基因型基本可以檢測到。現(xiàn)有的檢測方法包括探針雜交、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和實(shí)時熒光PCR。探針雜交由于過程復(fù)雜，已基本不采用，現(xiàn)主要采用RT-PCR和實(shí)時熒光PCR，是檢測病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。檢測基本過程包括RNA核

13、酸提取、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物觀察。 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：可準(zhǔn)確、靈敏地檢測標(biāo)本中的諾如病毒,尤其是低濃度的感染 。該方法最大優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)一步進(jìn)行病毒基因型的研究，這對于流行病學(xué)具有重要意義。缺點(diǎn)：糞便中抑制PCR反應(yīng)的成分多，可能影響PCR反應(yīng)，造成假陰性，對此可通過稀釋標(biāo)本降低抑制物濃度來解決。由于諾如病毒基因變異大，目前還沒有一對引物能把所有的基因型都檢測出來，這也可能造成假陰性，因此如果流行病學(xué)特征明顯，但檢測結(jié)果陰性，應(yīng)考慮換用其它引物進(jìn)行檢測。采用套式PCR方法還可進(jìn)一步提高檢測的靈敏度，也可提高特異性。 實(shí)時熒光PCR ：特異性和敏感性較傳統(tǒng)RT-PCR高，出現(xiàn)假陽性的機(jī)率也遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)RT-PCR，但受病毒核酸變異影響較RT-PCR大。目前國內(nèi)商業(yè)化的試劑主要針對GII的病毒，因此如果檢測結(jié)果為陰性不能排除該病毒感染。 五、治療目前無特效的抗病毒藥物，以對癥和支持治療為主，一般不需要使用抗生素，預(yù)后良好。脫水是諾如病毒感染性腹瀉的主要死因，對嚴(yán)重病例尤其是幼兒及體弱者應(yīng)及時輸液或口服補(bǔ)液，以糾正脫水、酸中毒及電解質(zhì)紊亂。 六、預(yù)防與控制在流行地區(qū)根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情