微生物生理生化實驗報告

1、實驗十IMViC與硫化氫試驗指導教師：李?；ㄖ芰谌M學號：060122010041姓名：宋天佳專業(yè)：2010級水產(chǎn)養(yǎng)殖學號：030212010025姓名：皇昊專業(yè)：2010級化學1班學號：060122010055姓名：續(xù)鵬輝專業(yè)：2010級水產(chǎn)養(yǎng)殖一、實驗目的了解IMViC與硫化氫反應的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。二、實驗原理IMViC是I一吲哚（indoltest）、M甲基紅（methylredtest）、V伏-普（Voges-Prolauertest）和C一檸檬酸鹽（citratetest）4個實驗的縮寫。這4個實驗主要用來快速鑒別產(chǎn)氣桿菌與大腸桿菌，多用于水的細菌檢查。大腸桿菌

2、雖非致病菌，但在飲用水時若超過一定指標，則表示水質(zhì)受糞便污染。產(chǎn)氣桿菌也廣泛存在于自然界中，因此檢查水是要將兩者分開。硫化氫（H2S）實驗也是檢查腸道細菌的生化實驗。（一）吲哚試驗（indoltest）吲哚試驗是用來檢測吲哚試驗的產(chǎn)生，有些細菌分解培養(yǎng)基中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），經(jīng)與試劑中的對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。色氨酸+H20色氨酸酶吲哚+NH3+丙酮酸吲哚+對二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚（紅色）只有部分細菌能產(chǎn)生色氨酸酶，從而具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚實驗可以作為一個生化檢測指標。大腸桿菌產(chǎn)色氨酸酶實驗結(jié)果為陽性（紅色），產(chǎn)氣腸桿菌不產(chǎn)色氨酸酶實驗結(jié)果為陰

3、性（無色）。（二）M-甲基紅試驗（methylredtest）用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。細菌代謝糖產(chǎn)生酸使培養(yǎng)基變酸（pH下降），使甲基紅指示劑變色：橘黃色（pH6.3）紅色（pH4.2）盡管，所有腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌有區(qū)別：兩者在培養(yǎng)早期產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后仍能維持酸性pH4,而產(chǎn)氣腸桿菌則將有機酸轉(zhuǎn)化為非酸性產(chǎn)物，使pH上升至6左右。因此，大腸桿菌為陽性（紅色），產(chǎn)氣腸桿菌陰性（黃色）。（三）伏-普實驗（Voges-Prolauertest）測定細菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物（如丙酮酸）的能力。丙酮酸進行縮合

4、、脫羧生成乙酰甲基醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，及伏-普反應陽性，不產(chǎn)生紅色化合物者為反應陰性。堿性條件、加入少量含胍基的化合物可使反應更明顯。大腸桿菌不產(chǎn)丙酮酸實驗結(jié)果為陰性（無色），產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)丙酮酸實驗結(jié)果為陽性（紅色）。葡萄糖丙酮酸-CO2縮合乙酰乳酸-CO2脫羧乙酰甲基甲醇+0H-2H胍基+二乙酰紅色化合物（四）檸檬酸鹽試驗（citratetest）用來檢測檸檬酸鹽是否被利用，有些細菌以檸檬酸鈉為碳源，培養(yǎng)基中的檸檬酸和磷酸銨被分解后，產(chǎn)生堿性化合物，使pH升高，當加入1%溴麝香草酚藍指示劑時，培養(yǎng)基就會有綠

5、色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{色，溴麝香草酚藍指示范圍：pHV6黃色，pH67綠色，pH7藍色。大腸桿菌不能利用檸檬酸鹽實驗結(jié)果為陰性（綠色），產(chǎn)氣腸桿菌能利用檸檬酸鹽實驗結(jié)果為陽性（藍色）。（五）硫化氫實驗用來檢測硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細菌檢查的常用生化實驗。含硫有機物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分細菌分解產(chǎn)生H2S，H2S和培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽反應，形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。大腸桿菌不能分解含硫有機物實驗結(jié)果為陰性（無沉淀），產(chǎn)氣腸桿菌能分解含硫有機物實驗結(jié)果為陽性（黑色沉淀）。三、實驗器材1、菌種：大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌斜面各一支。2、培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽

6、培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基3、溶液和試劑：甲基紅指示劑，40%KOH，5%-萘酚溶液，乙醚，吲哚試劑4、儀器或其他用具：試管架，接種環(huán)等四、操作步驟一）實驗準備葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配制：蛋白胨3g，葡萄糖3g,磷酸氫二鉀1.2g，水600ml,溶解，調(diào)節(jié)Ph7.,0-7.2,分裝于70支試管中，112C滅菌30min。2檸檬酸鹽培養(yǎng)基配制：NH4H2PO40.2g,K2HPO40.2g,NaCllg,MgSO440mg,檸檬酸鈉0.4g，瓊脂4g,調(diào)節(jié)pH6.8,1%溴香草酚藍乙醇液2ml,水200ml,溶解，分裝于20支試管中，121C滅菌20min。（pH不宜偏高，以淡綠色為宜

7、）硝酸鹽還原培養(yǎng)基配制：蛋白胨1.25g，氯化鈉0.625g，硝酸鉀0.25g，水125ml,溶解，調(diào)節(jié)pH7.4左右，分裝于16支試管中，121C滅菌20min。硫化氫試驗養(yǎng)基配制：蛋白胨5g,氯化鈉1.25g,檸檬酸鐵銨125mg,硫代硫酸鈉125mg,瓊脂5g,水250ml。先將瓊脂、蛋白胨融化，冷至60C時加入其他成分，調(diào)pH7.2左右，分裝于35支試管中，112C滅菌20min。二）接種與培養(yǎng)1穿刺法分別接種大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌于2支醋酸鉛培養(yǎng)基（H2S）,37C培養(yǎng)48h。2分別接種大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌于2支蛋白胨水培養(yǎng)基（I）、2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（M&V）,37C培養(yǎng)2d。3劃

8、S曲線法分別接種大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌于2支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基（C）,37C培養(yǎng)2d。三）結(jié)果觀察H2S實驗：觀察是否有黑色硫化鉛沉淀產(chǎn)生。吲哚實驗：2d后的培養(yǎng)物內(nèi)加34滴乙醚搖動數(shù)次，靜至13min,待乙醚上升后,沿管壁徐徐滴加2滴吲哚試劑，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物者為陽性反應。3甲基紅實驗：2d后的培養(yǎng)物內(nèi)加2滴甲基紅試劑，培養(yǎng)物變?yōu)榧t色者為陽性，黃色者為陰性（注意甲基紅不要過量，以免出現(xiàn)假陽性）。4伏一普實驗：2d后的培養(yǎng)物內(nèi)加510滴40%KOH,然后加入等量的5%-萘酚溶液,用力振蕩，紅色為陽性。5檸檬酸鹽實驗：觀察2d后的培養(yǎng)物上有無細菌產(chǎn)生及其顏色，藍色為陽性，綠色為陰性。

9、五、實驗結(jié)果將實驗結(jié)果填入下表?！啊北硎娟栃苑磻?，“”表示陰性反應。菌名IMViC試驗h2s試驗吲哚試驗甲基紅試驗伏普試驗檸檬酸鹽試驗大腸桿菌+產(chǎn)氣腸桿菌+六、討論吲哚試驗、甲基紅試驗、伏一普試驗、檸檬酸鹽試驗的實驗結(jié)果與理論結(jié)果一致。h2s試驗的實驗結(jié)果與理論結(jié)果不一致，兩支醋酸鉛培養(yǎng)基中都產(chǎn)生黑色沉淀，均為陽性反應，可能的原因：接種操作時，先穿刺接種產(chǎn)氣腸桿菌，之后，接種針未充分加熱滅菌，再穿刺接種大腸桿菌時混入部分大腸桿菌；接種針在接種產(chǎn)氣腸桿菌時，接種針上不粘上了產(chǎn)氣腸桿菌，未被加熱滅菌，再接種大腸桿菌時，將產(chǎn)氣腸桿菌混入，使大腸桿菌產(chǎn)生假陽性反應。吲哚試驗，實驗現(xiàn)象不明顯，可能的原因

10、：培養(yǎng)基中的色氨酸含量不夠高；吲哚試劑加入的量不夠，一部分粘在試管壁上損失掉，之后補加時乙醚已揮發(fā)；滴加吲哚試劑時動作不夠輕緩，破壞了紅色化合物的生成。為什么大腸桿菌是甲基紅反應陽性，而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性？這個試驗與伏普試驗最初底物和最終產(chǎn)物有何異同？大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解代謝途徑不同。大腸桿菌，可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至PH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅，即甲基紅反應陽性。產(chǎn)氣腸桿菌則使丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普陽性反應。說明在硫化氫試驗中醋酸鉛的作用,可以用哪種化合物代替醋酸鉛？醋酸鉛培養(yǎng)基（試紙）可檢驗硫化氫的產(chǎn)生，反應為：Pb（Ac）2+H2S=PbS（+