10食品中大腸菌群計數(shù)測定的標準操作規(guī)程

1、xxxxx公司食品中大腸菌群計數(shù)測定的標準操作規(guī)程編號起草人日期審核人日期批準人日期實施日期第 版文件密級1目的標準食品中大腸菌群計數(shù)測定的標準操作規(guī)程。2范圍本標準規(guī)定了食品中大腸菌群Coliforms計數(shù)的方法。本標準適用于食品中大腸菌群的計數(shù)。3術(shù)語和定義3.1 大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。3.2 最可能數(shù)most probable number，MPN基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。4責任質(zhì)量部組織制訂、化驗室負責實施。5內(nèi)容5.1設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：5.1.1 恒溫培

2、養(yǎng)箱：36 1 。5.1.2 冰箱：2 5 。5.1.3 恒溫水浴箱：46 1 。5.1.4 天平：感量0.1 g。5.1.5 均質(zhì)器。5.1.6 振蕩器。5.1.7 無菌吸管：1 mL具0.01 mL 刻度、10 mL具0.1 mL 刻度或微量移液器及吸頭。5.1.8 無菌錐形瓶：容量500 mL。5.1.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。5.1.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。5.1.11 菌落計數(shù)器。5.2培養(yǎng)基和試劑5.2.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨Lauryl Sulfate Tryptose，LST肉湯：見附錄A 中A.1。5.2.2 煌綠乳糖膽鹽Brilliant Gr

3、een Lactose Bile，BGLB肉湯：見附錄A 中A.2。5.2.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂Violet Red Bile Agar，VRBA：見附錄A 中A.3。5.2.4 磷酸鹽緩沖液：見附錄A 中A.4。5.2.5 無菌生理鹽水：見附錄A 中A.5。5.2.6 無菌1 mol/L NaOH：見附錄A 中A.6。5.2.7 無菌1 mol/L HCl：見附錄A 中A.7。5.3大腸菌群MPN 計數(shù)法檢驗程序大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗程序見圖1。圖1 大腸菌群MPN 計數(shù)法檢驗程序操作步驟.1 樣品的稀釋.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液

4、或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min10000 r/min 均質(zhì)1 min2 min,或放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min，制成1:10 的樣品勻液。.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。.1.3 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.57.5 之間，必要時分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。.1.4 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩

5、緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面，振搖試管或換用1 支1 mL 無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1 mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。.2 初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液液體樣品可以選擇原液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨LST肉湯，每管接種1mL如接種量超過1 mL，那么用雙料LST肉湯，361 培養(yǎng)24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是

6、否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣那么繼續(xù)培養(yǎng)至48 h2 h，產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。.3 復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯BGLB管中，36 1培養(yǎng)48 h2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。.4 大腸菌群最可能數(shù)MPN的報告按.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表見附錄B，報告每gmL樣品中大腸菌群的MPN值。5.4大腸菌群平板計數(shù)法檢驗程序大腸菌群平板計數(shù)法的檢驗程序見圖2。圖2 大腸菌群平板計數(shù)法檢驗程序操作步驟.1 樣品的稀釋按.1進行。.2 平板計數(shù).2.1 選取2

7、個3個適宜的連續(xù)稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL生理鹽水參加無菌平皿作空白對照。.2.2 及時將15 mL20 mL冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36 1 培養(yǎng)18 h24 h。.3 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15 CFU150 CFU 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。.4 證實試驗從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的

8、典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，36 1 培養(yǎng)24 h48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。.5 大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每gmL樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，那么該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/gmL=6.0105CFU/gmL。附錄A標準性附錄培養(yǎng)基和試劑A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨LST肉湯A.1.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g氯

9、化鈉5.0 g乳糖5.0 g磷酸氫二鉀K2HPO42.75 g磷酸二氫鉀KH2PO42.75 g月桂基硫酸鈉0.1 g蒸餾水1 000 mLpH 6.80.2A.1.2 制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。A.2 煌綠乳糖膽鹽BGLB肉湯A.2.1 成分蛋白胨10.0 g乳糖10.0 g牛膽粉oxgall或oxbile溶液200 mL0.1%煌綠水溶液13.3 mL蒸餾水800 mLpH 7.20.1A.2.2 制法將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，參加牛膽粉溶液200 mL將20.0 g脫水牛膽粉溶于200

10、 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.07.5，用蒸餾水稀釋到975 mL，調(diào)節(jié)pH，再參加0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補足到1 000 mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。A.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBAA.3.1 成分蛋白胨7.0 g酵母膏3.0 g乳糖10.0 g氯化鈉5.0 g膽鹽或3號膽鹽1.5 g中性紅0.03 g結(jié)晶紫0.002 g瓊脂15 g18 g蒸餾水1 000 mLpH 7.40.1A.3.2 制法將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調(diào)節(jié)pH。煮沸2 min，將培養(yǎng)基冷卻至45 50 傾注平板。

11、使用前臨時制備，不得超過3 h。A.4 磷酸鹽緩沖液A.4.1 成分磷酸二氫鉀KH2PO434.0 g蒸餾水500 mLpH 7.2A.4.2 制法貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 高壓滅菌15 min。A.5 無菌生理鹽水A.5.1 成分氯化鈉8.5 g蒸餾水1 000 mLA.5.2 制法稱取8.5氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 高壓滅菌15 min。A.6 1 mol/L NaOHA.6.1 成分NaOH 40.0 g蒸餾水1000 mLA.6.2 制法稱取40 g氫氧化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中