川牛膝和懷牛膝化學(xué)成分提取分離及含量測定研究進(jìn)展

1、PAGE 12 -川牛膝和懷牛膝化學(xué)成分提取分離及含量測定研究進(jìn)展梁林輝杜翠華梁大偉摘要川牛膝和懷牛膝為道地藥材，臨床使用廣泛，療效顯著，其成分三萜皂苷類、甾酮類、多糖類生物活性顯著，為其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)?？偨Y(jié)國內(nèi)外公開發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)川牛膝和懷牛膝中三萜皂苷類、甾酮類、多糖類成分的提取分離及含量測定研究進(jìn)行綜述，以期為其有效成分進(jìn)一步研究及開發(fā)提供參考。關(guān)鍵詞川牛膝;懷牛膝;化學(xué)成分;提取分離;含量測定中圖分類號(hào)R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2022）09-0012-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.004開放科學(xué)（資源服務(wù)）

2、標(biāo)識(shí)碼（OSID）：TheResearchProgressonExtractionandDeterminationMethodsofChemicalConstituentsinCyathulaeRadixandAchyranthisBidentataeRadixpolysaccharidesLIANGLin-hui，DUCui-hua，LIANGDa-wei（YaanPolytechnicCollege，Yaan，Sichuan625000）AbstractCyathulaeRadixandAchyranthisBidentataeRadixpolysaccharidesaregenuinec

3、rudedrugs.Itsclinicalapplicationisextensive，andtheactivatedingredientsaretriterpenoidsaponins，steronecompoundsandpolysaccharide.ThispapersummarizestheextractionanddeterminationmethodsofchemicalconstituentsinCyathulaeRadixandAchyranthisBidentataeRadixpolysaccharides，andprovidesareferenceforitsfurther

4、developmentandutilizationKeywordsCyathulaeRadix;AchyranthisBidentataeRadixpolysaccharides;Chemicalconstituent;Extraction;Determination川牛膝為莧科植物川牛膝CyathulaofficinalisKuan的干燥根，是川產(chǎn)道地藥材，主要產(chǎn)自雅安市天全縣、寶興縣、漢源縣以及樂山的金河口區(qū)，重慶、云南、貴州亦有分布;懷牛膝為河南省焦作市特產(chǎn)，是中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。它們具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的功能，用于經(jīng)閉癥瘕、胞衣不下、跌撲損傷、風(fēng)濕痹痛、足痿筋攣、尿血血淋

5、治療，臨床療效顯著?；瘜W(xué)成分主要有三萜皂苷類1、甾酮類2及多糖類3，有少量的生物堿、黃酮類等成分。近年來，關(guān)于川牛膝和懷牛膝的研究主要集中于化學(xué)成分鑒定及藥理學(xué)研究，其有效成分的提取、分離純化及含量測定研究較少，該研究從主要有效成分三萜皂苷類、甾酮類、多糖類的提取分離及含量測定方面進(jìn)行綜述，以期為牛膝的進(jìn)一步開發(fā)利用提供借鑒。1三萜皂苷1.1提取分離方法三萜皂苷類化合物是川牛膝主要成分之一。羅懿釩等4綜述了牛膝中有效成分，發(fā)現(xiàn)39種三萜皂苷類化合物，其中7種為川牛膝中含有，主要為齊墩果酸型皂苷。王麗景5采用正交試驗(yàn)考察了乙醇濃度、料液比、提前時(shí)間、提取次數(shù)等因素對(duì)牛膝中皂苷提取效果的影響，最優(yōu)

6、工藝為乙醇濃度為80%、料液比18、回流提取2次，每次3h，牛膝總皂苷含量可達(dá)1.889mg/mL，大孔樹脂吸附處理，含量可達(dá)60%。王俊等6分別以甲醇、乙醇為提取溶劑，比較超聲法、回流提取法和索氏提取法，發(fā)現(xiàn)乙醇提取效率明顯高于甲醇，超聲提取法與索氏提取法提取效率相當(dāng)，均高于回流提取法。程永杰等7采用正交試驗(yàn)法篩選出牛膝中總皂苷的最佳提取工藝為藥材10倍量的80%乙醇為溶劑，提取3次，每次1h。柳立新等8比較了甲醇回流提取、乙醇回流提取、乙醚索氏提取除雜再用甲醇回流提取、水超聲提取和乙醇超聲提取5種方法，發(fā)現(xiàn)70%乙醇超聲提取和回流提取總皂苷的含量較高，分別為4.97%和4.75%。尚風(fēng)琴9

7、以70%乙醇為提取溶劑，料液比110，比較了超聲法、回流法和浸漬法3種提取方法，結(jié)果顯示最佳提取方式順序?yàn)榛亓魈崛〗n提取超聲提取，進(jìn)一步正交試驗(yàn)考察了乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)和提取時(shí)間4個(gè)因素，最優(yōu)提取工藝為采用90%乙醇為提取溶劑，料液比為112，提取3次，每次1h，川牛膝總皂苷含量達(dá)10.97mg/g。目前針對(duì)川牛膝皂苷類化合物提取分離研究較少，通過上述文獻(xiàn)研究可知，川牛膝皂苷類化合物提取分離可采用乙醇回流提取法，通過有機(jī)溶劑萃取去除脂溶性成分，然后經(jīng)大孔樹脂進(jìn)行分離純化，該方案簡單易行，且易于工業(yè)化。1.2含量測定方法三萜皂苷類化合物含量檢測主要為紫外分光光度法和液相色譜法。衛(wèi)修來等

8、10利用三萜總皂苷可與高氯酸-香草醛試劑顯色的原理，建立了紫外分光光度法測量牛膝總皂苷，以齊墩果酸為對(duì)照品，最大吸收波長為544nm，該方法測得懷牛膝中總皂苷平均含量為6.24%;利用同一比色法方法，最大吸收波長為547nm，柳立新等8測得土牛膝中總皂苷含量最高為4.97%。王麗景5選取最大吸收波長為527nm，測定牛膝提取純化后總皂苷含量為60%，由于比色法所用的顯色劑專屬性較差，可能是造成最大吸收波長差異較大的原因。歐麗蘭等11-12采用高效液相色譜法（HPLC）測定土牛膝中齊墩果酸含量、比較懷牛膝與川牛膝中皂苷含量的不同。尚風(fēng)琴9建立了川牛膝總皂苷的HPLC-MS指紋圖譜，測得大孔樹脂富

9、集后的川牛膝皂苷總提取物含量為52.5%。閆文靜等13采用HPLC-ELSD法較好地分離了兩種皂苷，并測定其含量。2甾酮2.1提取分離方法川牛膝中甾酮類化合物多達(dá)13種，主要為杯莧甾酮及其類似物，是川牛膝發(fā)揮藥理作用的重要化學(xué)成分。2022版中國藥典規(guī)定，川牛膝中杯莧甾酮含量不得少于0.03%。王龍等14采用正交試驗(yàn)法考察了水量、提取溫度、提取時(shí)間和次數(shù)3個(gè)因素對(duì)牛膝中甾酮的提取效率影響，最優(yōu)工藝為料液比150，溫度50100，提取2次，每次2h，水煮提取物中蛻皮甾酮含量為9.30%。同時(shí)，還以水為溶劑提取牛膝總甾酮15，分別按料液比120、115水煎煮2次，每次2h，提取液經(jīng)D型大孔樹脂處理

10、，考察pH、吸附流速、洗脫液種類及用量對(duì)牛膝總甾酮的影響，在最優(yōu)分離條件下，D型大孔樹脂對(duì)牛膝甾酮的吸附量為28.9mg/g，純化后的牛膝總甾酮含量達(dá)60%，蛻皮甾酮含量達(dá)10%。孟大利等16-17以乙醇為提取溶劑，采用回流提取法，經(jīng)大孔樹脂脫糖純化、系統(tǒng)溶劑萃取、硅膠色譜柱層析分離，得到漏蘆甾酮B、旌節(jié)花甾酮D和紅莧甾酮;林大專等18采用類似提取分離方法得到3種蛻皮甾酮。蒙漢富等19以甲醇或水為提取溶劑，采用正交試驗(yàn)法考察了甲醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑倍量4種因素，最佳提取工藝為60倍量30%甲醇超聲提取2次，每次1.5h。孔飛飛等20采用回流提取法考察了乙醇濃度、溶劑倍量及提取時(shí)間3

11、個(gè)因素對(duì)杯莧甾酮的提取效率影響，最優(yōu)提取工藝為用70%乙醇加熱回流提取2次，料液比分別為112和110，提取時(shí)間均為2h。孫亮亮等21采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了超聲法提取甾酮，以正丁醇水溶液為提取溶劑，考察了溶劑、料液比及提取時(shí)間對(duì)-蛻皮甾酮提取效率的影響，最優(yōu)工藝為45%正丁醇溶液，料液比為115，提取時(shí)間1.7h。歐陽文等22采用甲醇回流提取3次，每次2h，提取液濃縮后經(jīng)制備型ODS層析柱、硅膠柱層析分離得-蛻皮箔酮、牛膝甾酮、水龍骨甾酮3種單體化合物。朱婷婷等23采用乙醇滲漉提取，濃縮液經(jīng)系統(tǒng)溶劑萃取、柱層析分離得25S-牛膝甾酮、25R-牛膝甾酮和-牛膝甾酮單體化合物。除了上述常規(guī)溶劑提取

12、法外，鄭義哲24采用二氧化碳超臨界流體萃取法提取蛻皮甾酮，首先探索夾帶劑對(duì)提取蛻皮甾酮的影響，確定最優(yōu)工藝條件是以二甲亞砜為夾帶劑，壓力25MPa、溫度70，夾帶劑流速0.5mL/min，靜態(tài)萃取時(shí)間10min，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間1h，二氧化碳流量2L/min。綜上可知，鑒于試驗(yàn)條件及制備量的因素，川牛膝中甾酮類化合物可采用有機(jī)溶劑提取法，大孔樹脂分離純化，再結(jié)合有機(jī)溶劑（乙酸乙酯、正丁醇）萃取法可得到含量較高的甾酮類化合物，如分離單體化合物須經(jīng)多次層析分離等方法來實(shí)現(xiàn)。2.2含量測定方法甾酮類與三萜皂苷具有相似的結(jié)構(gòu)母核，可以采用香草醛-高氯酸比色法測量甾酮含量。王龍等25利用該方法，以-蛻皮甾酮

13、為對(duì)照，在最大吸收峰550nm處，紫外分光光度法測得大孔樹脂富集后的牛膝提取物總甾酮含量為53.3%。劉姣等26以同樣的方法，采用最大吸收波長243nm，測定懷牛膝中總甾酮含量為2.089%。顯色法專屬性較差，目前甾酮類化合物含量檢測主要為高效液相色譜法。胡亮等27-28采用反向色譜柱測定粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝、杯莧甾酮含量。尚風(fēng)琴9利用HPLC-MS法構(gòu)建懷牛膝和川牛膝總甾酮指紋圖譜。川牛膝中甾酮類化合物主要為杯莧甾酮、羥基杯莧甾酮、森告甾酮等，2022版中國藥典規(guī)定了川牛膝中杯莧甾酮的檢測方法，采用HPLC法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為2

14、43nm。綜上可知，可利用HPLC法測定川牛膝甾酮類單體化合物的含量，該方法簡單，結(jié)果可靠。3多糖3.1提取分離方法最新研究表明，川牛膝多糖類成分具有很好藥理活性。劉穎華等29采用水提醇沉法得川牛膝多糖粗品，經(jīng)陰離子交換樹脂和凝膠分離，得多糖純品，總收率為22.5%。趙磊等30以熱水為提取溶劑，經(jīng)氯仿萃取，濃縮后醇沉得到川牛膝粗多糖，考察提取時(shí)間、料液比、溫度、提取次數(shù)4種因素對(duì)多川牛膝粗多糖提取效率的影響，最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比115，提取溫度60，浸提時(shí)間2h，提取1次，醇沉濃度85%，川牛膝多糖的收率為49.18%。侯劍萍等31采用水煎煮法提取粗多糖，經(jīng)脫蛋白、脫鹽和醇沉法純化，最佳提取純

15、化工藝為料液比110，提取3次，每次2h，采用三氯乙酸（TCA）法脫蛋白，分子篩法脫鹽處理，80%乙醇沉淀。梁歌等32采同樣的水提醇沉法提取川牛膝粗多糖，通過正交試驗(yàn)考察了提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響，最佳提取工藝為提取溫度100，提取時(shí)間8h，料液比120，95%乙醇溶液。黃志芳等33采用75%乙醇回流提取，經(jīng)水提取、濃縮、醇沉，收集沉淀，再用三氯乙酸除去蛋白、醇沉、有機(jī)溶劑洗滌等步驟得到牛膝多糖，收率為7.2%，含量達(dá)12.85%。劉傳敏等34采用酶解超聲法提取川牛膝多糖，正交試驗(yàn)考察了酶解時(shí)間、酶用量、pH、酶解溫度對(duì)酶解效果的影響和樣品粒度、料液比、超聲時(shí)間、超

16、聲次數(shù)對(duì)提取效果的影響。最佳工藝條件為酶解1h，酶用量15U/g，pH5.0，酶解溫度50，粒度20目，料液比140，超聲時(shí)間20min。谷旭晗等35采用同樣的酶法提取川牛膝多糖，通過正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件為藥材粒徑550830m、酶用量4mg/g、酶解溫度50、酶解時(shí)間90min、溶劑pH為5.0、料液比160，提取時(shí)間30min，在此條件下，川牛膝多糖收率為71.7%。葉秀娟等36以復(fù)合酶解法進(jìn)行提取，最佳提取工藝為料液比120、復(fù)合酶用量0.7%、pH6.0、溫度45，該條件下提取的川牛膝多糖含量大于52%。魏濤等37利用超聲波輔助提取懷牛膝多糖，經(jīng)石油醚和乙醇脫脂除雜，水為溶劑，正交

17、試驗(yàn)確定最優(yōu)提取條件為超聲功率1000W、提取溫度60、提取時(shí)問60min、料液比130，懷牛膝多糖提取率為6.1%。姜艷等38采用同樣方法提取牛膝多糖，最后經(jīng)醇沉得到牛膝多糖，收率達(dá)到11.7%。趙玥琪等39以川牛膝為原料，比較了超聲輔助提取法與煎煮法提取多糖的效率，發(fā)現(xiàn)在相同的提取溫度、時(shí)間和料液比情況下，超聲波提取法比煎煮提取效率高9.8%。除了上述超聲波提取法，微波輔助法也應(yīng)用于牛膝多糖的提取分離研究中40-41。此外，蒸汽爆破預(yù)處理法有助于牛膝多糖的提取42。多糖純化工藝中，采用醇沉、萃取法除蛋白等方法較多，殼聚糖為絮凝劑有助于川牛膝的總多糖絮凝純化43。3.2含量測定方法多糖測定方

18、法主要為苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法比色法。丁淑彬等44-45采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸顯色法，在490nm波長處對(duì)川牛膝中多糖的含量進(jìn)行了測定，該法簡單快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好。張純等46改良了蒽酮-硫酸比色法測牛膝多糖，經(jīng)典的蒽酮-六十顯色法反應(yīng)條件為蒽酮試劑濃度為0.2%，反應(yīng)溫度100，反應(yīng)時(shí)間10min，波長620nm，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度會(huì)改變最大吸收波長，優(yōu)化后的反應(yīng)條件更改為反應(yīng)溫度20，其他條件不變。李根林等47比較了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法2種方法對(duì)多糖含量檢測的影響，發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法顯色靈敏度高于蒽酮-硫酸顯色法。除了上述比色法測量多糖外，多糖經(jīng)水解為單糖后可利用高效液相色譜

19、法進(jìn)行測定，王小燕等48利用牛膝多糖的柱前衍生化，建立懷牛膝多糖的柱前衍生化-HPLC指紋圖譜及單糖含量測定方法，可為懷牛膝飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。4小結(jié)該研究主要對(duì)川牛膝和懷牛膝中三萜皂苷類、甾酮類及多糖3種主要成分的提取分離與含量測定進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)研究主要集中在化學(xué)成分和藥理學(xué)研究，對(duì)3種主要成分的批量純化工藝研究較少，對(duì)單體化合物的檢測方法研究還不足。川牛膝做為川產(chǎn)道地藥材，未來可進(jìn)一步針對(duì)有效成分的分離及純化進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步開發(fā)川牛膝的應(yīng)用提供有力支撐。安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2022年參考文獻(xiàn)1LIUYH，HEKZ，YANGM，etal.Structureofabioactivefructa

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24、究J.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2022，31（6）：48-51.22歐陽文，羅懿釩，李震，等.土牛膝抗炎成分分離、鑒定與含量測定研究J.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2022，32（7）：1171-1181.23朱婷婷，梁鴻，趙玉英，等.牛膝甾酮25位差向異構(gòu)體的分離與鑒定J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2022，39（11）：913-916.24鄭義哲.牛膝中甾酮類成分的提取分離D.杭州：浙江大學(xué)，2022.25王龍，胥秀英，鄭一敏，等.紫外分光光度法測定牛膝總甾酮含量J.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2022，16（1）：18-19.26劉姣，李清，曹秀蓮，等.懷牛膝藥材中牛膝總甾酮的含量測定J.河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2022，22（2）：3

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