綠茶提取物及表沒食子兒茶素沒食子酸酯對免疫細(xì)胞的作用研究

1、綠茶提取物及表沒食子兒茶素沒食子酸酯對免疫細(xì)胞的作用研究張鳳，楊桂文，張福淼，趙靜，崔英杰，安利國【摘要】目的研究綠茶提取物和表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGG對脾臟細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞N分泌的影響。方法采用TT法檢測脾臟細(xì)胞增殖變化，用Griess試劑法檢測N產(chǎn)量的變化。結(jié)果綠茶提取物和EGG都可以促進(jìn)脾臟細(xì)胞增殖，并可以協(xié)同nA刺激脾臟細(xì)胞的增殖；還可以抑制LPS激活的巨噬細(xì)胞RA264.7的N產(chǎn)量。結(jié)論綠茶提取物和EGG具有免疫調(diào)節(jié)和減輕炎癥反響的有益作用?！娟P(guān)鍵詞】綠茶表沒食子兒茶素沒食子酸酯免疫細(xì)胞Abstrat：bjetiveTstudytheeffetfgreenteaextratan

2、dEpigallatehingallateEGGnspleenellprliferatinandarphageNprdutin.ethdsTTassayasusedtdetetspleenellprliferatinhangeandGriessreagentethdasusedtdetetarphageNseretin.ResultsGreenteaextratandEGGuldprtespleenellprliferatinandbeabletperateithnAtstiulatespleenellprliferatin.TheyuldalsinhibitLPS-ativatedarpha

3、gesRA264.7Nprdutin.nlusinGreenteaextratandEGGhaveiunregulativeeffetandanalleviateinflaatryreatin.Keyrds：Greentea;EGG;Iuneells現(xiàn)代研究說明綠茶具有抗氧化、抗癌和防癌、降血糖、抑菌和抗病毒等生物學(xué)活性15。在人們?nèi)找孀⒅乇＝○B(yǎng)生的今天，綠茶的系列生物學(xué)活性無疑也成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用山東日照綠茶為材料，用70乙醇法抽提得到綠茶提取物，研究其對免疫細(xì)胞的作用。1器材昆明種小鼠山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。EGGSiga；綠茶提取物70乙醇法抽提；RPI1640干粉GIB；小牛血清

4、杭州四季青生物工程材料；噻唑藍(lán)Siga；青霉素、鏈霉素北京鼎國生物技術(shù)開展中心；nASiga；LPSSiga；DR顯微鏡LEia；-17A二氧化碳培養(yǎng)箱SANY；del550酶標(biāo)儀BI-RAD。紅細(xì)胞裂解液：NH4l8.29g，KH31g，EDTANa37.2g。將以上試劑溶解于800l三蒸水，充分?jǐn)嚢枞芙饣靹蚝螅?N的鹽酸調(diào)pH值至7.27.4，加水補(bǔ)足到1000l。過濾除菌，4保存?zhèn)溆谩riess試劑：A液：對氨基苯磺酰胺0.5g，10醋酸150l；B液：萘胺0.1g，三蒸水20l，10醋酸150l，冰箱中保存，使用前A液B液等體積混合。2方法2.1TT法測定小鼠脾臟細(xì)胞的增殖取實(shí)驗(yàn)小

5、鼠，脫頸處死。無菌條件下取出脾臟，剪碎，200目尼龍網(wǎng)過濾。搜集的細(xì)胞以無血清RPI1640培養(yǎng)液洗滌兩遍，搜集后加紅細(xì)胞裂解液，中止裂解后搜集細(xì)胞，以無血清RPI1640培養(yǎng)液洗滌兩遍，重懸細(xì)胞于RPI1640培養(yǎng)液中。調(diào)整脾臟細(xì)胞濃度為2106ells/l，置于96孔板中，綠茶提取物或EGG作用48h及綠茶提取物或EGG與nA20g/l共作用48h。實(shí)驗(yàn)終止前4h每孔加TT(5g/l)20l，離心，棄上清液中止反響，每孔加150l二甲基亞砜，輕輕搖動30in溶解紫色結(jié)晶，490n波長酶標(biāo)儀比色。SI=nA刺激后A值/未加刺激A值2.2GriessS法測定巨噬細(xì)胞RA264.7N產(chǎn)量N的定量

6、可通過測定N2-和N3-的總和來實(shí)現(xiàn)，根據(jù)這一原理，應(yīng)用GriessS試劑來定量檢測N程度。巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清與GriessS試劑室溫下反響10in，于490n處檢測吸光值。3結(jié)果3.1TT法測定小鼠脾臟細(xì)胞的增殖3.1.1綠茶提取物對小鼠脾臟細(xì)胞增殖的影響TT法檢測綠茶提取物對小鼠脾臟細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果說明它不僅能刺激脾臟細(xì)胞增殖，而且也能協(xié)同nA刺激脾臟細(xì)胞的增殖。見圖12。3.1.2EGG對小鼠脾臟細(xì)胞增殖的影響TT法檢測EGG對小鼠脾臟細(xì)胞增殖情況說明：EGG體外也可以刺激脾臟細(xì)胞的增殖，并協(xié)同nA刺激脾臟細(xì)胞增殖。見圖34。3.2GriessS法測定巨噬細(xì)胞RA264.7N產(chǎn)量綠茶提

7、取物和EGG都可以降低LPS激活巨噬細(xì)胞RA264.7N產(chǎn)量，濃度越高，作用越強(qiáng)見圖56。圖1綠茶提取物體外刺激脾臟細(xì)胞增殖略圖2綠茶提取物對nA刺激的脾臟細(xì)胞增殖的影響略圖3EGG體外對脾臟細(xì)胞增殖的影響略圖4EGG對nA刺激的脾臟細(xì)胞增殖的影響略圖5綠茶提取物對LPS激活巨噬細(xì)胞RA264.7N產(chǎn)量的影響略圖6EGG對LPS激活巨噬細(xì)胞RA264.7N產(chǎn)量的影響略4討論脾臟內(nèi)的大量免疫細(xì)胞是其執(zhí)行免疫功能的根底,其中包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritiell,D)等。脾臟既可通過吞噬作用完成機(jī)體的非特異性免疫功能,也可以通過T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫完成機(jī)體

8、的特異性免疫功能,脾臟同時也是產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞、B細(xì)胞的重要場所,對再次免疫應(yīng)答起重要作用6。T淋巴細(xì)胞在非特異性物質(zhì)刺激下，可被激活向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化過程中DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成增加，使細(xì)胞分裂增殖。淋巴細(xì)胞的分裂增殖那么是其發(fā)揮作用大小的一個衡量指標(biāo)。nA激活T細(xì)胞增殖時可釋放IL-2與IFN-等多種淋巴因子，且IFN-有促腎上腺皮質(zhì)激素和-內(nèi)啡肽的活性片斷，均具有免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)說明綠茶提取物和EGG都可以刺激脾臟細(xì)胞增殖，并且可以協(xié)同nA促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。因此，它們都能促進(jìn)免疫活性物質(zhì)的釋放，具有免疫調(diào)節(jié)作用。同時，T細(xì)胞引起的特異性免疫應(yīng)答在機(jī)體去除病原體、移植免疫和

9、抗腫瘤免疫中有重要作用。T細(xì)胞還可以分泌淋巴因子在多個環(huán)節(jié)上參與免疫調(diào)節(jié)7，8。綜上，綠茶提取物及EGG可以通過促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖和免疫活性物質(zhì)的釋放來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬才能和殺傷才能，是近年來研究比擬活潑的一種重要的免疫活性細(xì)胞。它們既參與非特異性免疫這一重要的生理過程，又可以呈遞抗原，產(chǎn)生細(xì)胞因子參與特異性免疫應(yīng)答。N是巨噬細(xì)胞等對病原體和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的效應(yīng)分子，主要由活化的巨噬細(xì)胞等大量的表達(dá)一氧化氮合酶時產(chǎn)生。一氧化氮合酶在正常生理情況下不表達(dá)，主要在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和免疫細(xì)胞等受到細(xì)胞因子如IFN-，TNF-，Il-2，Il-1等及細(xì)菌脂多糖LPS作

10、用時被激活而產(chǎn)生，先表達(dá)iNS的RNA，再生成iNS，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)時間長且大量的N9，10。高程度的N對細(xì)胞主要發(fā)揮細(xì)胞毒作用，N本身有毒性，能抑制線粒體酶，如檸檬酸合成酶、烏頭酸酶等，此外N能與超氧陰離子-2反響產(chǎn)生一種氧化性更強(qiáng)的自由基過氧亞硝酸鹽N-，這種自由基很穩(wěn)定，一旦進(jìn)入靶細(xì)胞或鄰近細(xì)胞將引起強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用甚至損傷組織，因此，測定巨噬細(xì)胞產(chǎn)生N的變化情況，對判斷機(jī)體免疫狀態(tài)具有重要的意義。利用內(nèi)毒素LPS作為巨噬細(xì)胞RA264.7的N合成誘導(dǎo)劑，參加不同濃度綠茶提取物或EGG，培養(yǎng)后取上清液，測定N產(chǎn)生量。發(fā)現(xiàn)綠茶提取物和EGG對LPS誘導(dǎo)的N合成均有明顯的抑制作用，其抑制

11、作用具有顯著的量效關(guān)系。因此，綠茶提取物和EGG一定意義上都可以抑制炎癥介質(zhì)的生成，從而減輕炎癥反響。然而，這種作用是如何發(fā)揮的，是通過抑制一氧化氮合酶的產(chǎn)量和活性還是通過其他途徑，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。綜上所述，綠茶提取物體外具有免疫調(diào)節(jié)和減輕炎癥反響等有益作用，這就為開發(fā)綠茶提供了實(shí)驗(yàn)基矗【參考文獻(xiàn)】1ShutHA,YaR.TeaasaptentialhepreventiveagentinPhIParingenesis:effetsfgreenteaandblakteanPhIP-DNAaddutfratininfealeF-344ratsJ.Nutraner，2000,36(1):52.

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