分子生物物理

1、分子生物物理蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)及解析蛋白質(zhì)分子的折疊蛋白質(zhì)分子的相互作用蛋白質(zhì)分子認(rèn)識蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 1 蛋 白 質(zhì) 概 述一. 蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)的最重要的物質(zhì) 蛋白質(zhì)約占細(xì)胞干重的50%以上。蛋白質(zhì)與核酸共同構(gòu)成了生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)，是細(xì)胞原生質(zhì)的主要成分。催化生物體內(nèi)幾乎所有化學(xué)反應(yīng)的酶是蛋白質(zhì)。抵抗外源性異物侵害而產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗體是蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的許多激素也是蛋白質(zhì)或多肽。肌肉收縮、物質(zhì)的運輸、結(jié)締保護(hù)、病毒對宿主的感染等都是蛋白質(zhì)在起作用。胚胎發(fā)育、生長、分化和繁殖等都有蛋白質(zhì)參與。二、蛋白質(zhì)的元素組成 蛋白質(zhì)主要含有C、H、O、N以及S元素。N元素是蛋白質(zhì)的特征性元素，根

2、據(jù)對大多數(shù)蛋白質(zhì)的N元素分析，其含量相近，一般在1517% ，平均為16% 。三、蛋白質(zhì)的基本組成單位是氨基酸 經(jīng)水解分析，構(gòu)成氨基酸的蛋白質(zhì)約20種，這些氨基酸借肽鍵聚合成蛋白質(zhì)。四、蛋白質(zhì)是由基因編碼合成的 直接參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸在遺傳上都存在相應(yīng)的密碼，這些密碼子存在于基因的核苷酸順序中，分子生物學(xué)研究表明，基因的核苷酸順序通過轉(zhuǎn)錄拷貝到mRNA上，mRNA的編碼信息，即三聯(lián)密碼子直接決定著蛋白質(zhì)多肽的氨基酸順序。凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：蛋白質(zhì)含量生物樣品含N量6.25蛋白質(zhì)工廠：核糖體 2 氨基酸 ( Amino acids )一. 氨基酸的結(jié)構(gòu)通式 除脯氨酸外，其它所有

3、氨基酸在結(jié)構(gòu)上都有一個共同的特點，即在與羧基相連的-碳原子上含有一個氨基。從這個結(jié)構(gòu)通式可以看出，氨基酸的差別就表現(xiàn)在側(cè)鏈R基團(tuán)上。L-氨基酸的結(jié)構(gòu)通式二. 氨基酸的結(jié)構(gòu)和分類： 根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。 1. 非極性R基氨基酸（共9種）： 甘氨酸(Glycine,Gly,G), 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 纈氨酸(Valine,Val,V), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 脯氨酸(Proline,Pro,P), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,

4、Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M)2.無電荷的極性R基氨基酸（共6種）：絲氨酸(Serine,Ser,S), 蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)3.帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R),組氨酸(Histidine,His,H)4.帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D)

5、,谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)+三氨基酸的構(gòu)型:(Stereoisomers 立體異構(gòu)體） 氨基酸的構(gòu)型是以D-、L-甘油醛為標(biāo)準(zhǔn)確定的。除甘氨酸外，19種氨基酸的碳原子為不對稱碳原子（手性碳原子），故有L-和D-兩種構(gòu)型。 說明： 1）只L-型氨基酸才存在于蛋白質(zhì)中,D-型氨基酸存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和某些抗菌素中。 2）19種氨基酸有“左旋”（-）和“右旋”（+）之分。但與L-或D-無固定的對應(yīng)關(guān)系。荷蘭人：范托夫 四、紫外吸收特性： 酪氨酸和色氨酸在280nm處具紫外吸收特性，蛋白質(zhì)通常含有這樣的氨基酸，故可以在280nm處測定蛋白質(zhì)的含量。 五、氨基酸的酸堿性質(zhì)1. 氨基

6、酸的兩性解離性質(zhì) 氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)下主要以兩性離子形式存在 作為酸： R-CH-COO- R-CH-COO- H | | NH3 NH2 作為堿： R-CH-COO- H R-CH-COOH | | NH3 NH3 通過改變?nèi)芤旱膒H，可使氨基酸分子的解離狀態(tài)發(fā)生改變。 氨基酸在酸性環(huán)境中，主要以陽離子的形式存在，在堿性環(huán)境中，主要以陰離子的形式存在。在某一pH環(huán)境下，以兩性離子（兼性離子）的形式存在，帶有相等正、負(fù)電荷，該pH稱為該氨基酸的等電點pI。 等電點是氨基酸的特征常數(shù)解離常數(shù)：Ka1=A0H+A+Ka2=A-H+A0 當(dāng)?shù)味ㄖ良嫘噪x子有一半變成陰離子,即A0=A-時,則

7、Ka2=H+,兩邊取對數(shù)得pKa2=pH,此乃pH9.60處拐點。根據(jù)以下公式及pKa等數(shù)據(jù)，可計算出任一pH值下一種氨基酸的各種離子的比例： pK=pKa+lg 質(zhì)子受體質(zhì)子供體酸堿滴定曲線六氨基酸的電泳分離和離子交換：1. 氨基酸的電泳分離 電泳(Electrophoresis)是指帶電質(zhì)點在電場中的移動。如果帶電質(zhì)點在恒定電壓和恒定粘度的介質(zhì)中泳動，帶電質(zhì)點的遷移率()可用下式表示： Q/r 如果它們在大小方面也沒有明顯的的差別，帶電質(zhì)點的遷移率可用下式表示： Q 各氨基酸所帶凈電的差異（Q）可用pI- pH表示。2. 離子交換層析是分離分析氨基酸的有效方法 離子交換劑共價地結(jié)合許多可解

8、離為陰離子或陽離子的基團(tuán)，可以與周圍溶液中的其它相反離子或離子化合物結(jié)合。 當(dāng)把被分離的氨基酸混合物的溶液調(diào)至pH3.0時, 氨基酸都帶凈正電荷。但由于每種氨基酸的電離狀態(tài)不同，因而它們的凈正電荷的程度也不同，故被洗脫下來的速度也不相同。除了電荷作為主要分離因素外，氨基酸側(cè)鏈與樹脂的非極性骨架之間的相互作用也是影響分離的因素。 現(xiàn)在常用高效液相層析(HPLC) 代替普通的離子交換層析。七、氨基酸的化學(xué)反應(yīng) 1、與茚三酮反應(yīng)羧基和氨基共同參加的反應(yīng)所有氨基酸都能與茚三酮發(fā)生顏色反應(yīng)脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì) 2、與2,4-二硝基氟苯的反應(yīng)(Sanger 反應(yīng))： (用于鑒定多肽或蛋

9、白質(zhì)的N-末端氨基酸)3、與異硫氫酸苯酯（PITC）的反應(yīng)(Edman降解)： (一種對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序的化學(xué)方法) 3 肽一肽、肽鏈和肽鍵 氨基酸與氨基酸之間可以通過-氨基和-羧基在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)脫水縮合形成的酰胺鍵共價地結(jié)合在一起,這樣形成的產(chǎn)物叫做肽（Peptide）。在蛋白質(zhì)化學(xué)中，這種酰胺鍵稱為肽鍵（Peptide bond）。 由氨基酸借肽鍵所形成的一條線性的鏈狀分子就叫做肽鏈(peptide chain) 。在肽鏈結(jié)構(gòu)中,每個的氨基酸不再是完整的，因此叫做氨基酸殘基（residue）。蛋白質(zhì)是由單一肽鏈或多條肽鏈構(gòu)成的大分子。一般地，凡氨基酸殘基數(shù)目在50個以上，且具有特定空間結(jié)構(gòu)

10、的肽稱蛋白質(zhì)；凡氨基酸殘基數(shù)目在50個以下，且無特定空間結(jié)構(gòu)者稱多肽。若按氨基酸殘基平均分子量110計，則蛋白質(zhì)分子量范圍大約是5,000-550,000 Da。 除某些特殊的環(huán)狀小肽外，寡肽和多肽都是線性分子，仍然保留一個未反應(yīng)的氨基末端（N-末端）和一個羧基末端（C-末端）。在某些蛋白質(zhì)中，N-末端往往被甲酰基或乙?；忾]；也有些蛋白質(zhì)的C-末端被修飾成酰胺。二肽的性質(zhì)1肽鍵可被水解：酸、堿環(huán)境下2肽的解離性質(zhì) 肽是一類多聚兩性電解質(zhì)，隨環(huán)境pH的變化，可以電離成帶正電荷、負(fù)電荷或者凈電荷為零等不同的狀態(tài)。每一種多肽都有它的等電點，可通過酸堿滴定曲線來確定。等電點的差別反映出它們的氨基酸組

11、成不同和側(cè)鏈可電離基團(tuán)的種類和性質(zhì)的差別。三生物活性肽 幾乎所有生物體內(nèi)部都存在多種非蛋白質(zhì)肽。這類物質(zhì)都有相應(yīng)的生物活性，盡管人們并不完全清楚它們的功能。通常我們把這些肽類統(tǒng)稱為生物活性肽。生物活性肽在組成、結(jié)構(gòu)和大小方面存在很大的差異。重要的有谷胱甘肽、神經(jīng)肽、肽類激素等。1. 谷胱甘肽（GSH）：全稱為-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巰基可氧化、還原，故有還原型（GSH）與氧化型（GSSG）兩種存在形式。 谷胱甘肽的生理功用：解毒作用：與毒物或藥物結(jié)合，消除其毒性作用；參與氧化還原反應(yīng)：作為重要的還原劑，參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)；保護(hù)巰基酶的活性：使巰基酶的活性基團(tuán)-SH維持還原狀態(tài)；維持紅細(xì)

12、胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定：消除氧化劑對紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。 2. 多肽類激素：種類較多，生理功能各異。主要見于下丘腦及垂體分泌的激素。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次一級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)primary structuresecondary structuretertiary structurequariernary structure超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域 supersecondary structurestructure doman 4 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和測定 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定是指蛋白質(zhì)分子中氨基酸排列順序的測定。有二條途徑：一條是直接測定多肽鏈的氨基酸順序；另一條是間接的，即從編碼蛋白質(zhì)的基因的

13、核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。牛核糖核酸酶C末端N末端一測定方法：獲得高純度的單一蛋白樣品，測定其分子大小。確定肽鏈的數(shù)目(末端分析)； 氨基酸的組成分析； 拆開二硫鍵；部分水解；片段的氨基酸順序測定； 片段重疊，拚出完整肽鏈的氨基酸順序； 確定二硫鍵和酰胺基的位置。 1. 氨基酸的組成分析 蛋白質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)酸水解后, 進(jìn)行氨基酸的組成分析，通過組成分析基本上可推測出部分水解所產(chǎn)生的肽碎片的數(shù)目。 2末端分析(確定蛋白質(zhì)的肽鏈組成) ：通常測定肽鏈的N-末端. 二硝基氟苯(DNFB)法 或丹磺酰氯（DNS-Cl）法是常用的方法。丹磺酰氯為一種更有效的試劑，靈敏度比DNFB法高100倍

14、。 DNFB法分析N-端氨基酸殘基N-端殘基的鑒定： 蛋白質(zhì)多肽的N-端游離 -NH2與2，4-二硝基氟苯或丹磺酰氯(DNS)反應(yīng)6 N HCl水解斷裂所有肽鍵分離與二硝基苯基或丹磺酰氯連接的N-端氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)比較定。Sanger兩次獲得諾貝爾化學(xué)獎1958年和1980年3.拆開鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵 1).還原法：用巰基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫蘇糖醇等還原性試劑使二硫鍵打開，還原生成-SH。 2).氧化法：常用過甲酸(CHOOOH)作為氧化劑，使二硫鍵氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸殘基) 。4.肽鏈的部分水解 常用胰蛋白酶法, 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是一個典型的多肽，用胰蛋

15、白酶(糜酶)、胰凝乳蛋白酶和溴化氰分別處理所得到的結(jié)果： AlaArgArgMetPheAlaLysAsp-Phe-Leu-Lys丙氨酸 精氨酸 精氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 丙氨酸 賴氨酸 天冬氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 賴氨酸 用胰酶處理： 用糜酶處理： 用溴化氰處理： Ala-Arg Ala-Arg-Arg-Met-Phe Ala-Arg-Arg-Met Arg Ala-Lys-Asp-Phe Phe-Ala-Lys-Asp-Phe-Lys Asp-Phe-Leu-Lys Leu-Lys Met-Phe-Ala-Lys多肽裂解專一試劑：胰蛋白酶糜蛋白酶胃蛋白酶溴化氰5肽碎片的氨基酸順序分析：

16、Edman降解法：專用試劑是苯異硫氰酸酯。苯異硫氰酸酯 羧肽酶法：羧肽酶A：從C-末端依次降解末端殘基，含芳香環(huán)的或脂肪烴基較大的殘基易被水解。但該酶不能水解C-末端的Arg、Lys和Pro。羧肽酶B能專門水解C-末端的Arg和Lys，對其它殘基不起作用。如果C-末端第二個殘基是Pro，則酶A和酶B都不起作用。羧肽酶C能水解C-末端的Pro.6.片斷重疊確定整個肽鏈的氨基酸順序：胰酶：Ala-Arg Arg Met-Phe-Ala-Lys Asp-Phe-Leu-Lys糜酶：Ala-ArgArg-Met-Phe Ala-LysAsp-Phe Leu-Lys-全順序Ala-ArgArg-Met-

17、Phe-Ala-LysAsp-Phe-Leu-Lys測多肽鏈數(shù)拆分多肽鏈斷開鏈內(nèi)二硫鍵氨基酸組成分析鑒定N末端和C末端殘基裂解多肽鏈測各肽段氨基酸序列“片段重疊”法推出一級結(jié)構(gòu)二硫鍵定位蛋白質(zhì)測序（Protein sequencing）總結(jié) 基本步驟二蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的生物學(xué)意義：1. 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異 同源蛋白質(zhì)(homologous proteins)如細(xì)胞色素c的一級結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化的關(guān)系：2.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的個體差異 以血紅蛋白(Hemoglobin)為例： HbA: H3NVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysCOO HbS: H3NVal-His-L

18、eu-Thr-Pro-Glu-Val-LysCOO 5 蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)概述 一.蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的概念及研究方法 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象 是指蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈在空間上的走向及所有原子和基團(tuán)在空間中的排列與分布。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)包括二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。 X-射線晶體衍射和核磁共振光譜是研究大分子結(jié)構(gòu)的主要方法。 X-射線晶體衍射可用來研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),核磁共振(NMR)光譜可用來研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。維系蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是氫

19、鍵。定義 肽鍵平面由于肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，使參與肽鍵構(gòu)成的六個原子被束縛在同一平面上，這一平面稱為肽鍵平面或肽單元。（一）肽單元由于-碳原子與其他原子之間均形成單鍵，因此兩相鄰的肽鍵平面可以作相對旋轉(zhuǎn) (二）蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折疊 ( -pleated sheet ) -轉(zhuǎn)角 ( -turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ) 1. -螺旋： -螺旋是多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的螺旋構(gòu)象 結(jié)構(gòu)特征： 為一右手螺旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè) 螺旋每圈包含3.6個氨基酸殘基,螺距 0.54nm；每個殘基偏轉(zhuǎn)100; 螺旋以氫鍵維系（氨

20、基酸的N-H和相鄰第四個氨基酸的羰基氧C=O之間。氫鍵方向與螺旋軸基本平行） 2. -折疊 -折疊是由若干肽段或肽鏈排列起來所形成的扇面狀片層構(gòu)象-折疊包括平行式和反平行式兩種類型結(jié)構(gòu)特征： 由若干條肽段或肽鏈平行或反平 行排列組成片狀結(jié)構(gòu)； 主鏈骨架伸展呈鋸齒狀； 涉及的肽段較短，一般為510個 氨基酸殘基； 借相鄰主鏈之間的氫鍵維系。3. -轉(zhuǎn)角：-轉(zhuǎn)角（ U形轉(zhuǎn)折,發(fā)夾結(jié)構(gòu)）：是多肽鏈180回折部分所形成的一種二級結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)特征為： 主鏈骨架本身以大約180回折; 回折部分通常由四個氨基酸殘基構(gòu)成; 構(gòu)象依靠第一殘基的-CO基與第四殘基的-NH基之間形成氫鍵來維系。 (4)主要有兩種類型：I 型和II型；二者主要差別是中央肽基旋轉(zhuǎn)了1800， (5) 一些氨基酸如Pro、Gly經(jīng)常出現(xiàn)在-轉(zhuǎn)角中； II型-轉(zhuǎn)角中的第三個氨基酸殘基總是Gly。 4. 無規(guī)卷曲：無規(guī)卷曲是指多肽鏈主鏈部分形成的無規(guī)律的卷曲構(gòu)象。約占球蛋白分子結(jié)構(gòu)的一半；蛋白質(zhì)（酶）的功能部位常常位于這種構(gòu)象之中。RNase的分子結(jié)構(gòu)-螺旋-折疊-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲（三）模體(motif)在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，被稱為模體 鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體螺旋折疊折疊2個His和2個Cys 與Zn