DNA測(cè)序的基本策略

1、DNA測(cè)序的基本策略 設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長(zhǎng)度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測(cè)的DNA鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷裂或終止。通過高分辨率的電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的DNA片段分開，根據(jù)DNA片段長(zhǎng)短排列順序及其末端堿基就可讀出待測(cè)DNA的堿基序列。 雙脫氧末端終止法 化學(xué)法 測(cè)序技術(shù)進(jìn)展+-Mark有相同的起點(diǎn),不同終點(diǎn)的一套DNA片段示意圖電泳圖譜 雙脫氧末端終止法測(cè)序原理酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCAACT35GG53引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPd

2、ATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGTTGCTACC35TCAACGATGG53讀出模板互補(bǔ)序列讀出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的測(cè)序儀示意圖computer analysis凝膠中DNA移動(dòng)方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件DNA的化學(xué)測(cè)序示意圖 反

3、應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼測(cè)序技術(shù)進(jìn)展同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳 單色熒光標(biāo)記平板電泳同位素標(biāo)記平板電泳ACGTACGT測(cè)序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T引物標(biāo)記法測(cè)序(Dye Primer)一個(gè)樣本，4個(gè)反應(yīng)。4個(gè)反應(yīng)中引物序列相同，但分別標(biāo)記有不同顏色的熒光。+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddATP (terminator) 反應(yīng)結(jié)束后，將4管反應(yīng)液混合，經(jīng)乙醇沉淀后上樣+AmpliTaq FS enzymedCTP,

4、 dATP, dGTP, dTTPddGTP (terminator)+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddCTP (terminator)+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddTTP (terminator)終止法測(cè)序(Dye Terminator)一個(gè)樣本，1個(gè)反應(yīng)。反應(yīng)中包含分別帶4色熒光標(biāo)記的ddNTP(終止子)unlabeled primertemplate DNA+AmpliTaq FSdATP, dCTP, dGTP, dTTPddCTPddATPddGTPddTTP 測(cè)序反應(yīng)結(jié)束后，

5、采用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，除去過量的ddNTP后上樣。連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NADAMP+PPi或NMN+AMPTCPTTPPPGAPACPPPPOHGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3AGAACCTTG3555533模板鏈模板鏈目的基因的獲取1、建立DNA和cDNA文庫2、體外擴(kuò)增PCR技術(shù)3、人工合成重組DNA技術(shù)路線1基因文庫(DNA library) 基因文庫是指整套由基因組DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆之總和。應(yīng)用DNA重組技術(shù)，可以將各種生物體全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定重組體中，以備需要時(shí)應(yīng)用。好象將文獻(xiàn)資料貯存于圖書

6、館一樣，所以稱其為genomic library。 cDNA文庫（complemental DNA library） 將細(xì)胞全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和稱為cDNA文庫?；蛭膸旌蚦DNA文庫的建立可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長(zhǎng)度分級(jí)甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫的滴度和特性擴(kuò)增后供長(zhǎng)期儲(chǔ)存篩選出所需要的克隆組織DNA克隆的載體1、質(zhì)粒2、噬菌體3、動(dòng)物病毒4、植物寄生菌重組DNA技術(shù)路線2重組DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化(transformation)：以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。2、轉(zhuǎn)染(Tr

7、ansfection ):以噬菌體或真核病毒為載體構(gòu)建的重組體依靠對(duì)細(xì)胞的感染功能導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。3、電穿孔法(electroporation):高壓脈沖電流使細(xì)胞產(chǎn)生臨時(shí)的通透性以吸收DNA。4、微注射法(microinjection):借助極細(xì)針管的幫助把DNA注射入細(xì)胞核的方法。重組DNA技術(shù)路線4電穿孔法示意圖細(xì)胞壁原生質(zhì)膜纖維素酶電穿孔細(xì)胞壁再生瞬間的開口外來的DNA插入外源DNA的植物細(xì)胞pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)噬菌體感染大腸桿菌的途徑噬菌體突變型作為克隆載體DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

8、RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNAcDNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯RNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶植物冠癭瘤（其表達(dá)產(chǎn)物幫助T-DNA轉(zhuǎn)移和整合）鱆魚堿Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)編碼兩類酶：植物生長(zhǎng)激素和細(xì)胞分裂素合成酶冠癭氨基酸或冠癭堿合成酶篩選克隆細(xì)胞 載體特征的直接篩選 菌落的原位雜交 免疫學(xué)方法重組DNA技術(shù)路線5pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu) 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活原位雜交法篩選DNA重組體圖解用NaOH將菌體裂解，變性的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn)細(xì)菌菌落

9、單鏈DNA結(jié)合到膜上將菌落復(fù)印至硝酸纖維素膜上重組DNA表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測(cè)32P-抗體裂解細(xì)胞，表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上與放射性抗體雜交的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)轉(zhuǎn)化到E.Coli細(xì)菌啟動(dòng)子插入的真核DNA片段放射自顯影重組體Southern和Western印跡法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacr

10、ylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography胰島素原的人工合成胰臟(A)n胰島素原mRNAcDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRNA反轉(zhuǎn)錄酶胰島素原基因與質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化E.coli胰島素原Ti質(zhì)粒為載體的植物基因工程I 二元載體系統(tǒng)II 共整合載體III T-DNA的轉(zhuǎn)移與整合Ti輔助質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒 pBR型質(zhì)粒（給體質(zhì)粒

11、）宿主特異性外源基因宿主特異性整合帶有外源基因的Ti質(zhì)粒植物DNATi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并插入植物DNA蛋白質(zhì)技術(shù)和核酸技術(shù)的相互增強(qiáng)插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞推導(dǎo)出AA順序制備合成肽制備對(duì)所編碼蛋白專一的抗體基因或cDNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)測(cè)定出AA順序合成cDNA探針制備專一的抗體沉淀核糖體分離mRNA用Southern印跡法篩選DNA文庫基因或cDNA DNA芯片(DNA chip)技術(shù)是采用寡核苷酸原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬計(jì)的DNA探針片段有序地固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，反應(yīng)結(jié)果通過檢測(cè)雜交信號(hào)的方法（同位素法、化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法或酶標(biāo)法）顯示，再用精密的掃描儀或CCD攝象技術(shù)記錄，通過計(jì)算機(jī)軟件分析，綜合成可讀的IC總信息，來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的快速、并行、高效地檢測(cè)或診斷。 芯片分析實(shí)際上也是傳感器分析的組合。芯片陣列中的每一個(gè)單元微點(diǎn)都是一個(gè)傳感器的探頭，所以傳感器技術(shù)的精髓往往都被用于芯片的發(fā)展。陣列檢測(cè)可以大大提高檢測(cè)效率，減少工作量，增加可比性，所以芯片技術(shù)也是傳感器技術(shù)的發(fā)展。DNA芯片技術(shù)簡(jiǎn)介DVA芯片工