現(xiàn)代微生物學(xué)實驗技術(shù)市公開課獲獎?wù)n件

1、綠色糖單孢菌發(fā)酵及胞外酶提取北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院-10-20第1頁第1頁試驗?zāi)坷斫獍l(fā)酵應(yīng)用廣泛性理解利用發(fā)酵罐進行高密度培養(yǎng)技術(shù)掌握發(fā)酵罐使用原理和辦法掌握酶活測定辦法第2頁第2頁試驗原理綠色糖單孢菌（Saccharomonospora viridis）是一個耐熱耐堿放線菌，產(chǎn)胞外木素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶。發(fā)酵：微生物把一些原料養(yǎng)分在適當(dāng)發(fā)酵條件下經(jīng)特定代謝路徑轉(zhuǎn)變成所需產(chǎn)物過程。影響發(fā)酵條件：培養(yǎng)基成份、溫度、誘導(dǎo)時機及誘導(dǎo)劑、溶解氧、pH等。第3頁第3頁試驗材料菌株：綠色糖單孢菌（Saccharomonospora viridis）培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：大豆蛋白胨1%、酵

2、母粉0.2%、酶水解酪素0.2%、氯化鈉0.6%、葡萄糖1%發(fā)酵培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物0.2% xylanpH 7.88.0滅菌溫度：115，30min第4頁第4頁試驗辦法環(huán)節(jié)：種子液的準(zhǔn)備固體培養(yǎng)基挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于45、120rpm，3d發(fā)酵培養(yǎng)取一定比例的種子培養(yǎng)基接于發(fā)酵培養(yǎng)基中（1:200）粗酶液提取10000rpm、4離心15min酶活測定木聚糖酶活 xylanase第5頁第5頁數(shù)據(jù)分析生長曲線及產(chǎn)酶曲線木聚糖酶比活（包括木糖原則曲線、蛋白含量原則曲線等）第6頁第6頁生長曲線及產(chǎn)酶曲線生長曲線測定：在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，從接種后每6h取樣（3ml），測定其在O

3、D600條件下吸光度值，至發(fā)酵結(jié)束。以同條件下未接種培養(yǎng)液為空白對照，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌液OD600吸光度值為縱坐標(biāo)繪制綠色糖單孢菌在生長曲線。產(chǎn)酶曲線測定：在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，從接種后每6h取樣（2ml），分別測定其木聚糖酶和纖維素酶比活。第7頁第7頁木聚糖酶活測定辦法制作木糖原則曲線。用PH7磷酸緩沖液分別配制濃度1mg/mL木糖溶液。取十支帶有刻度25mL試管，分別吸入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL木糖溶液。加入磷酸緩沖液，使每支試管溶液體積為1.5mL。每支試管中加入1.0 mLDNS溶液，在沸水中反應(yīng)5min,反應(yīng)后快速冷卻至室溫。向每

4、支試管中加入10 mL蒸餾水，在540nm處測定溶液吸光值。第8頁第8頁木聚糖酶活測定辦法酶活測定辦法：粗酶液稀釋10倍作為待測酶液；用pH7磷酸緩沖液配制得到1%木聚糖溶液作為木聚糖酶底物，在試管中加入0.5mL底物，0.1mL酶液和0.9mL磷酸緩沖液，于60下水浴20min，加入1mLDNS試劑，在沸水中煮5min,冷卻后加蒸餾水10mL混勻后，540nm處測定其吸光度。第9頁第9頁蛋白含量測定辦法考馬斯亮藍(lán)G-250法蛋白質(zhì)濃度123456樣品蛋白ml（c=0.1mg/ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水ml1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)G-250ml555555蛋白含量g020406080100第10頁第10頁3組分工第一組：菌株S.v 發(fā)酵培養(yǎng)基：STS+xylan第二組：菌株S.v-artp1 發(fā)酵培養(yǎng)基：STS+xylan第三組：菌株S.v-artp2 發(fā)酵培養(yǎng)基：STS+xylan第11頁第11頁4組分工10.20 早晨 固體平板挑去單菌落接種于STS液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)； 準(zhǔn)備好活化液以1：200百分比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中45，120rpm發(fā)酵培養(yǎng)； 下午：16:00 取5ml發(fā)酵液，3ml用來測定吸光度，2ml編號存儲于4 22:00 取5ml發(fā)酵液，3ml用來測定吸光度，2ml編號存儲于4第12頁第12頁天天 早晨