串聯(lián)質(zhì)譜在新生兒篩查中應(yīng)用進(jìn)展

1、串聯(lián)質(zhì)譜用于遺傳代謝病的篩查診斷, 是開展苯丙酮尿癥篩查以來新生兒篩查史上最重要的進(jìn)展。它 主要通過穩(wěn)定性同位素【用】標(biāo)記在12種氨基酸和8種酰基肉堿(Cambridge Isotope Laboratories,Inc)上作為標(biāo)準(zhǔn)參照物來進(jìn)行定量分析，篩查出包括氨基酸病、有機(jī)酸代謝紊亂和脂肪酸 氧化缺陷在內(nèi)的30-40 種遺傳代謝病, 大大提高了篩查效率, 實(shí)現(xiàn)了“一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)一種疾病”到“一 種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種疾病”的轉(zhuǎn)變。一、概述新生兒疾病篩查是指在新生兒期通過對(duì)某些危害嚴(yán)重的遺傳代謝缺陷、先天性疾病進(jìn)行群體 篩查, 早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)，及時(shí)診斷，早期診治,從而避免或減輕疾病的危害。始于20 世紀(jì)

2、60 年代早期的新 生兒疾病篩查，從Gut hrie的細(xì)菌抑制法到放射免疫分析法、酶免疫吸附實(shí)驗(yàn)等，都屬于“一種實(shí)驗(yàn)檢 測(cè)一種疾病”的方法。其間，雖然不斷出現(xiàn)新的篩查技術(shù)如氣相色譜質(zhì)譜(GC/MS)、液相色譜質(zhì)譜(L C/ MS)等，但所有這 些技術(shù)具有分析周期長、樣品通量較低、假陽性較高等缺點(diǎn)， 不能滿足大規(guī)模的新生兒疾病篩查。近年發(fā)展起來的串聯(lián)質(zhì)譜法( tandem mass spectrometry ，MS/ MS) 具有快速、靈敏和選擇性強(qiáng)等特 點(diǎn)，自從應(yīng)用于新生兒疾病篩查以來,大大擴(kuò)展了篩查的疾病譜。MS/ MS主要通過對(duì)新生兒干血濾紙片中 的氨基酸、有機(jī)酸、?；鈮A的分析， 一次實(shí)

3、驗(yàn)可以同時(shí)篩查出包括氨基酸病、有機(jī)酸代謝紊亂、脂肪酸 氧化缺陷在內(nèi)的30-40種遺傳代謝病， 大大提高了篩查效率。二、MS/ MS的基本原理:質(zhì)譜主要是將被測(cè)物質(zhì)分子電離成各種質(zhì)荷比(m/ z )不同的帶電粒子，然后 應(yīng)用電磁學(xué)原理， 使這些帶電粒子按照質(zhì)荷比大小的空間在時(shí)間上產(chǎn)生分離依次排列通過四級(jí)桿而成的圖 譜，通過測(cè)定在單位時(shí)間內(nèi)帶電粒子峰的強(qiáng)度，以此獲得確定化合物的分子量、分子式。MS/ MS是由2 個(gè)質(zhì)譜室經(jīng)1個(gè)碰撞室串聯(lián)而成，其進(jìn)行新生兒疾病篩查的原理Milli ngt on 1 ,2 和Ras hed3 ，4 都作了相應(yīng)的報(bào)道。三、MS/ MS的篩查樣品準(zhǔn)備：MS/ MS分析的樣

4、品是采用干血濾紙片，在上MS/ MS儀前樣本處理分為衍生法和非衍 生法，干血濾紙片經(jīng)打孔后置于96 孔板中,加入同位素內(nèi)標(biāo), 經(jīng)甲醇抽提, 氮?dú)獯蹈?在經(jīng)過鹽酸-乙酰 氯衍生化后，再次氮?dú)獯蹈赏耆稍?，溶解于有機(jī)相中，進(jìn)行上MS/ MS儀測(cè)定。其中同位素內(nèi)標(biāo)的使用是 MS/ MS 定量分析的標(biāo)準(zhǔn)參照物， 同位素內(nèi)標(biāo)分子量分布相對(duì)于被測(cè)物而言是盡可能寬的，同時(shí)也應(yīng)考慮同 位數(shù)內(nèi)標(biāo)之間相互干擾等因素，才能達(dá)到既互不干擾又分析準(zhǔn)確。如在酪氨酸分析中，使用13C6 -環(huán)- 酪氨酸作內(nèi)標(biāo)，不會(huì)隨儲(chǔ)存時(shí)間而衰減，因此比酪氨酸-d4更穩(wěn)定5;用賴氨酸-dlO代替賴氨酸-d3可 以減少谷胺酰氨-d5的中性碎片

5、丟失中的脫氨基產(chǎn)物對(duì)賴氨酸-d3的碎片離子的影響。各種軟離子技術(shù), 尤其是電噴霧電離(ESI)與MS/ MS相結(jié)合，降低了對(duì)樣品的純度要求，而且使得進(jìn)樣自動(dòng)化，從而適 應(yīng)了新生兒疾病篩查高通量的要求。MS/ MS分析：應(yīng)用于新生兒疾病篩查的MS/ MS主要執(zhí)行3個(gè)掃描模式:母離子掃描、中性丟失 掃描和選擇反應(yīng)檢測(cè)或多反應(yīng)檢測(cè)。在母離子掃描中， 第二個(gè)質(zhì)譜室選擇特征的碎片離子， 測(cè)定第一個(gè)質(zhì) 譜室中的所有母離子。在中性丟失掃描中， 2個(gè)質(zhì)譜室在同樣的速度和方式下掃描，測(cè)得的質(zhì)譜強(qiáng)度顯示 出具有相同的碎裂方式的離子。在進(jìn)行選擇反應(yīng)檢測(cè)時(shí)， 2個(gè)質(zhì)譜室是靜止的，對(duì)每一樣品有選擇地檢測(cè) 某些母離子-

6、碎片離子對(duì)。數(shù)據(jù)獲取的方法依據(jù)分析目的不同而不同。它可以是單一的功能掃描， 如氨基 酸的中性丟失掃描和酰基肉堿的母離子掃描，也可以是多反應(yīng)檢測(cè)分析。大多數(shù)a-氨基酸在碰撞誘導(dǎo)裂 解(CID)作用下產(chǎn)生102Da的中性碎片丟失，少數(shù)氨基酸產(chǎn)生56Da (甘氨酸)、161Da (精氨酸)、 119Da(鳥氨酸)的中性碎片丟失，因此氨基酸分析一般采用中性丟失掃描。而在?；鈮A分析中，因其結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)與氨基酸不同，經(jīng)CID后產(chǎn)生的是具有共同結(jié)構(gòu)的85Da的碎片離子，所以主要采用母離子掃描方 式。但如果同時(shí)進(jìn)行氨基酸和?；鈮A分析， 較理想的分析應(yīng)該是多反應(yīng)檢測(cè)分析與母離子掃描或中性丟 失掃描相結(jié)合使用，

7、 并且在某些關(guān)鍵的物質(zhì)分析中幾種方式同時(shí)使用。每一掃描功能的數(shù)據(jù)獲取過程有一 定的時(shí)間分配， 主要依據(jù)樣品流量、掃描質(zhì)量范圍、掃描速度、相應(yīng)分析物的量、所需求的數(shù)據(jù)質(zhì)量及其 他參數(shù)而定。通過使用所謂的計(jì)算機(jī)輔助的代謝圖譜運(yùn)算法(CAMPA)的自動(dòng)化分析系統(tǒng)來變換不同的設(shè)備 模式處理復(fù)雜的數(shù)據(jù)， 能夠在2分鐘內(nèi)精確地分析不同物質(zhì)的組成， 從而更能適應(yīng)高通量的新生兒疾病篩 查。MS/ MS 結(jié)果處理： 遺傳代謝病是由于人體內(nèi)某些酶、膜或受體等生物合成的遺傳缺陷， 引起細(xì)胞 和體液內(nèi)毒性中間產(chǎn)物積聚或必需代謝產(chǎn)物的缺乏， 在血液中表現(xiàn)為相應(yīng)代謝物如氨基酸、?；鈮A的含 量增高或缺乏。MS/ MS結(jié)果

8、處理的一個(gè)重要方面是將代謝物質(zhì)譜轉(zhuǎn)換成有意義的臨床結(jié)果，這一過程主 要通過計(jì)算代謝物離子率而得， 即未知代謝物的豐度與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)豐度之比， 然后在預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線上 將比率轉(zhuǎn)換成濃度， 以篩查診斷相應(yīng)的遺傳代謝缺陷病。也可采用相應(yīng)的幾種代謝物之間的離子峰豐度比 來分析。方法的選擇對(duì)結(jié)果分析有很大的影響，如在苯丙酮尿癥(P KU)篩查中，使用Phe/ Ty r比的 精確性優(yōu)于Phe離子率，而且還可區(qū)分引起苯丙氨酸升高的幾種情況：經(jīng)典的PKU、BH4缺乏引起的P KU、一過性的苯丙氨酸升高。而在丙酸血癥篩查中，因?yàn)橐阴Ｈ鈮A(C2)在m/z 260的質(zhì)譜信息可能受 到谷氨酸雙丁基脂的干擾，因此使用丙

9、酰內(nèi)堿(C3)離子率比用C3/C2更有意義。MS/MS結(jié)果分析也受到不 同因素的影響，如肉豆蔻酰肉堿(C14)、棕櫚酰肉堿(C16)在早產(chǎn)兒中的濃度下降，而對(duì)于因母親營養(yǎng)障 礙導(dǎo)致的早產(chǎn)兒其Phe / Tyr率卻有所增高3 。酪氨酸濃度升高除酪氨酸血癥I型所致外，還見于其他 疾病，所以在酪氨酸血癥I型的分析篩查時(shí)，當(dāng)僅僅酪氨酸濃度升高，可通過快速分光光度儀間接地檢測(cè) 琥珀酰丙酮酸來加以分析，以排除其他疾病11 。MS/ MS還不能很好地區(qū)分同分異構(gòu)體，如在5碳酰基 肉堿分析中，甲基丁酰肉堿和異戊酰肉堿(C5)有著同樣的質(zhì)量和相應(yīng)的C5標(biāo)記，因此C5既可以表示2-甲基丁烷輔酶A脫氫酶缺乏，也可表

10、示異戊二酸血癥，這時(shí)就需要其他技術(shù)(如氣相色譜技術(shù))分析各 自的代謝產(chǎn)物(分別為甲基丁酰肉堿和異戊酰肉堿)。在楓糖尿癥(MSUD)的篩查中，m/ Z188的豐度既可 以是亮氨酸、異亮氨酸，也可以是別構(gòu)異亮氨酸， 尤其還存在羥脯氨酸、丙酰甘氨酸的干擾， 對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不 豐富的操作者來說更加難以區(qū)分，但如使用多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(如L C/ MS/ MS)則可避免這一問題。新生兒疾病篩查的擴(kuò)展：雖然MS/ MS早在1990年就已應(yīng)用于新生兒疾病篩查，但直到最近幾年 才在一些發(fā)達(dá)國家作為常規(guī)使用。隨著技術(shù)的發(fā)展和對(duì)遺傳代謝病認(rèn)識(shí)的深入, 不斷地有新的疾病加入 MS/ MS 分析的行列， 能夠篩查包括屬于氨基酸病

11、， 屬于有機(jī)酸代謝紊亂及屬于脂肪酸氧化缺陷的等大約 3040多種疾病。尤其是脂肪酸氧化缺陷在最近幾年逐漸得到重視，估計(jì)3 %6%的嬰兒猝死綜合征可 能是由脂肪酸氧化缺陷所引起，因此不斷地有作者通過MS/ MS把這類疾病列入新生兒疾病篩查中。假陽性與假陰性： MS/ MS 技術(shù)優(yōu)于其他技術(shù)的特點(diǎn)之一就是大大降低了篩查診斷的假陰性和假陽 性， 尤其對(duì)已作為常規(guī)篩查的疾病。有報(bào)道篩查苯丙酮尿癥數(shù)十萬例， 達(dá)到了零錯(cuò)誤率。但對(duì)于某些有機(jī) 酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷病來說,MS/MS還不能作為一個(gè)診斷實(shí)驗(yàn)。有人曾報(bào)道1例戊二酸血癥I型 的病人出現(xiàn)MS/MS分析假陰性的情況。此外，如果母親在分娩前使用過含

12、有三甲基醋酸的抗生素，就可 導(dǎo)致新生兒血液中含有與異戊酰肉堿有同樣分子量的三甲基醋酸酰肉堿含量升高，從而導(dǎo)致異戊酸血癥診 斷的假陽性。四、MS/ MS對(duì)其他遺傳代謝病的分析：MS/ MS除了用于氨基酸病、有機(jī)酸代謝紊亂和脂肪酸氧化缺 陷篩查外，還可用于溶酶體貯積癥(LSD)的診斷分析，已證實(shí)硫酸腦苷脂在異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、葡糖腦 苷脂在戈謝氏病中皆可以通過MS/ MS分析18 。也有人試圖利用對(duì)干血濾紙片中結(jié)合膽汁酸的定量分 析來篩查膽汁淤積的肝膽管性疾病， 但由于結(jié)合膽汁酸與氨基酸、?；鈮A的理化性質(zhì)不一樣， 其標(biāo)本必 須在出生后710天且在食后23 小時(shí)開始采集，同時(shí)標(biāo)本應(yīng)避光保存， 才能保證篩查的準(zhǔn)確性， 因此 還存在許多有待解決的問題。綜上所述， MS/ MS 技術(shù)正迅速地成為新生兒群體篩查的有力工具， 隨著各 國科學(xué)家的努力，將會(huì)有更多的疾病可以通過MS/ MS分析篩查,并且技術(shù)也會(huì)更趨于成熟。1.Milli nt on DSNowood DL ， KodoN ，etal .Anal Biochem， 1989，180:331 -339.2.Milli nt on DSKodo N ， NorwoodDL， etalJ I nhe ri