抗體工程制藥精品課件

1、抗體工程制藥第1頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 Contents of chapter 41、概述 2、單克隆抗體的制備 3、鼠源性單克隆抗體的改造 4、基因工程抗體和抗體工程 GoGoGoGoGo5、抗體藥物 第2頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 “疫”：流行性傳染病，免疫即免于發(fā)生傳染病。盡管近代才出現(xiàn)“免疫”這個詞，但是人們在遠(yuǎn)古時代就已認(rèn)識了免疫現(xiàn)象。公元前5世紀(jì)希臘半島的戰(zhàn)史中，描述了在傳染病流行時，由患過該病的人來護(hù)理病人和埋葬尸體的事例。公元384年，晉朝葛洪在肘后備急方中記載“療狂犬咬人方，乃殺所咬犬，取腦傅之，后不復(fù)發(fā)”

2、。4.1 抗體工程制藥概述1、有關(guān)免疫學(xué)知識第3頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 免疫是機(jī)體對異種、異體及自身物質(zhì)所產(chǎn)生的反應(yīng)，即機(jī)體“自我識別，排除異己”，以達(dá)到自身穩(wěn)定的一種復(fù)雜的生理性保護(hù)，并且與人體的胚胎發(fā)育、疾病發(fā)生、衰老等一系列的生命過程有密切關(guān)系，是人體進(jìn)化的結(jié)果。 免疫學(xué)是研究人類和實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)、外免疫反應(yīng)的本質(zhì)及其變化規(guī)律的科學(xué)。 免疫系統(tǒng)是由淋巴器官（胸腺、骨髓、淋巴結(jié)、脾和扁桃體）、淋巴組織以及免疫細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）借助血液和淋巴循環(huán)相互聯(lián)系而組成的功能系統(tǒng)。第4頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 T淋巴細(xì)

3、胞（表面有抗原識別受體）巨噬細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞（表面有抗原識別受體）人體內(nèi)三種主要的免疫細(xì)胞第5頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三巨噬細(xì)胞B細(xì)胞T細(xì)胞抗原識別受體目標(biāo)對象作用方式無有（表面有1000個抗原識別受體，有特異性）有（表面有10萬個抗原識別受體，有特異性）幾乎所有的抗原類物質(zhì)如細(xì)菌、病毒、衰老細(xì)胞。體液中的抗原（部分病毒除外），如細(xì)菌。吞噬或感染了病毒等抗原的細(xì)胞、外來器官等。吞噬產(chǎn)生抗體釋放細(xì)胞毒素三種免疫細(xì)胞的比較第6頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三外源蛋白、細(xì)菌、病毒等抗原B細(xì)胞作用過程(體液免疫)漿細(xì)胞B細(xì)胞產(chǎn)生抗體抗體使抗原失

4、去活性特異抗原識別受體第7頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三T細(xì)胞作用過程（細(xì)胞免疫）感染了抗原的細(xì)胞或吞噬了抗原的巨噬細(xì)胞，外來細(xì)胞。T細(xì)胞活性T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒素攻擊受感染細(xì)胞。受感染細(xì)胞死亡第8頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 自然被動免疫 母體的特異性抗體IgG通過胎盤或初乳中的分泌型IgA進(jìn)入胎兒體內(nèi)或嬰兒體內(nèi)，使胎兒或嬰兒被動的獲得母體抗體的方式。 嬰兒在出生后6個月內(nèi)很少得傳染病，是從母體獲得被動免疫的結(jié)果。 第9頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 自然自動免疫 在自然條件下，人體被病原體感染后所獲得的免疫力

5、。這種免疫可以通過得傳染病獲得，也可經(jīng)過隱性感染獲得。第10頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三宋朝（十一世紀(jì)）時吸入天花痂粉預(yù)防天花 ；明代（公元十七世紀(jì)七十年代左右）接種“人痘”，預(yù)防天花； 十八世紀(jì)后葉，英國鄉(xiāng)村醫(yī)生Jenner種“牛痘”預(yù)防天花。 第11頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三病原菌致病與疫苗十九世紀(jì)中葉，顯微鏡的改進(jìn)導(dǎo)致病原菌的發(fā)現(xiàn)；1850年在羊的血液中看到炭疽桿菌；Pasteur證明實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的炭疽桿菌能使動物感染致?。?Koch提出病原菌致病的概念； 正式認(rèn)識Jenner的接種牛痘苗、預(yù)防天花的科學(xué)性和重大意義。 第12頁

6、，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 人工自動免疫 用人工接種的方法向機(jī)體輸入抗原性物質(zhì)，使機(jī)體自己產(chǎn)生特異性免疫力。 免疫力出現(xiàn)較慢，人工接種后需經(jīng)14周誘導(dǎo)期方可產(chǎn)生；但維持時間達(dá)半年到數(shù)年不等，主要用于傳染病的特異性預(yù)防。 第13頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 白喉造成人類疾病有2500年的歷史，十八世紀(jì)初，在新英格蘭的白喉大流行，使得2.5的人口死亡，有三分之一的兒童死亡。在類毒素治療發(fā)明之前，白喉是15歲以下兒童的三大死因之一。 1884年，首次分離出白喉?xiàng)U菌，白喉?xiàng)U菌是一種革蘭氏陽性桿菌，在有氧及37的環(huán)境下，生長良好。 人的鼻咽部若

7、受到白喉?xiàng)U菌感染，會產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素，抑制正常細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，引起局部組織破壞及形成白色膜狀物，毒素可經(jīng)由血液到達(dá)全身，主要造成心肌炎、神經(jīng)炎，血小板低下及蛋白尿。第14頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三十九世紀(jì)八十年代后期，發(fā)現(xiàn)白喉?xiàng)U菌經(jīng)其分泌的白喉外毒素致病；隨后發(fā)現(xiàn)再感染者的血清中有“殺菌素”-抗體；1890年， Behring和Kitasato用白喉抗毒素治療白喉病人。第15頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 Behring（德）和 北里柴三郎(日)用白喉脫毒外毒素注射馬等動物，在動物血清中發(fā)現(xiàn)了一種能中和白喉外毒素的物質(zhì)，稱為抗毒素

8、。 以抗毒素對白喉患者進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)此種中和毒素的能力能被動地轉(zhuǎn)移給正常動物，使后者獲得抗白喉毒素的免疫力，因此稱這種方法為人工被動免疫法。此后很多人從免疫動物或傳染病病人血清中發(fā)現(xiàn)了多種能和微生物或其產(chǎn)物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)，通稱為抗體，而引起抗體產(chǎn)生的物質(zhì)稱為抗原?？乖涂贵w因能發(fā)生特異性結(jié)合，為診斷傳染病建立了血清學(xué)診斷方法。此二人在1901年共同獲得諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎。第16頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三人工被動免疫 采用人工方法向機(jī)體輸入由他人或動物產(chǎn)生的免疫效應(yīng)物，如免疫血清、淋巴因子等，使機(jī)體立即獲得免疫力，達(dá)到防治某種疾病的目的。 特點(diǎn)是產(chǎn)生作用快，輸

9、入后立即發(fā)生作用。但由于該免疫力非自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，易被清除，故免疫作用維持時間較短，一般只有23周。主要用于治療和應(yīng)急預(yù)防。第17頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三2、抗原 能刺激人或動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。抗原的基本性質(zhì)具有異物性、大分子性和特異性。ABO血型：紅細(xì)胞表面的糖蛋白末端寡糖的特點(diǎn)決定了它的抗原性。第18頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三3、抗體是免疫球蛋白 抗體是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。二十世紀(jì)三十年代，Tiselius和Kabat用電泳研究血清蛋白。

10、動物免疫后，血清中-球蛋白顯著增高。-球蛋白有Ab活性。第19頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三4、多克隆抗體的制備 抗淋巴細(xì)胞多克隆抗體的制備 采用人的淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或脾細(xì)胞作為抗原，經(jīng)過處理后接種到異種動物如馬或兔體內(nèi)，使其致敏產(chǎn)生各種針對人的淋巴細(xì)胞表面不同抗原決定族的多樣抗體，然后再將所采集的動物血清經(jīng)過一系列的分離、提純等處理，去除無關(guān)的其它雜抗體，從而獲得精制的抗淋巴細(xì)胞的多種免疫球蛋白（IgG）。 第20頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 器官移植后的排斥反應(yīng)是宿主T細(xì)胞被外來移植物抗原刺激活化之后所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而T細(xì)胞的完

11、全活化必須具備三個外來信號，即由抗原提呈細(xì)胞（APC）提供的移植物抗原（第一信號）和共刺激因子（第二信號）以及T細(xì)胞自分泌或旁分泌的促生長因子（第三信號）。這三個信號的糖蛋白分子都必須與T細(xì)胞表面的受體或配體結(jié)合，才能傳遞活化信號，引起T細(xì)胞的活化與克隆增殖。 第21頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 抗淋巴細(xì)胞多克隆抗體主要通過阻斷抗原與淋巴細(xì)胞的結(jié)合、殺滅和清除淋巴細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)免疫抑制效應(yīng)。但由于每批次產(chǎn)品制作所用的抗原（淋巴細(xì)胞）不同，或提純過程的流水線生產(chǎn)差異，不同批次的多克隆抗體產(chǎn)品間存在差異，療效不一。此外，多克隆抗體對淋巴細(xì)胞無關(guān)的抗原（包括血小板、紅細(xì)胞）

12、可發(fā)生交叉反應(yīng)而導(dǎo)致全血象的降低。 第22頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三PcAbMcAb基因工程抗體抗體組藥物 利妥昔單抗 Rituximab是1997年美國FDA批準(zhǔn)的、用于治療B細(xì)胞非霍杰金氏淋巴瘤，已達(dá)30多萬例病人。治療總有效率為50%，其療效與化學(xué)藥物相同，但更安全，幾乎無副作用，抗體聯(lián)合化療有效率高達(dá)80%以上。 Rituximab 500mg/支的價格為21000元左右，盡管價格高，但卻供不應(yīng)求，2005年市場銷售額近32億美元。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2005年治療性和診斷性抗體的銷售額大約為150億美元，治療性抗體的銷售達(dá)到120億美元。 第23頁，共95頁，20

13、22年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三1、單克隆抗體的原理 骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能無限增殖，免疫的B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，細(xì)胞融合后形成雜交瘤細(xì)胞；HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞；微量蛋白質(zhì)檢測技術(shù)篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。4.2 單克隆抗體的制備 第24頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三2、單克隆抗體的制備過程 抗原制備、免疫動物免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)、雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的克隆化 第25頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三單克隆抗體的檢定分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立單克隆抗體的

14、大量制備動物體內(nèi)誘生法體外培養(yǎng)法單克隆抗體的純化 第26頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 1982年，美國斯坦福醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家用小鼠制備的單克隆抗體治療B細(xì)胞淋巴瘤，治療后患者的病情緩解、瘤體消失。 1986年，美國FDA批準(zhǔn)世界上第一個單克隆抗體藥物莫羅單抗-CD3（OKT3）進(jìn)入市場，用于器官移植時的抗排斥反應(yīng)。在這個時期，抗體藥物的研制和應(yīng)用給人們治療疾病帶來了很大的期望。20年后的今天，單克隆抗體藥物已經(jīng)成為生物醫(yī)藥最重要的發(fā)展領(lǐng)域之一，到2006年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)23個治療性單克隆抗體藥物。 第27頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三

15、OKT3單抗主要和T細(xì)胞表面的CD3抗原結(jié)合，而CD3分子是與T細(xì)胞受體（TCR）緊密相聯(lián)在一起的一個復(fù)合體（TCR-CD3復(fù)合體）。這樣，OKT3就可通過封閉TCR而阻斷由APC提呈的啟動T細(xì)胞活化的第一信號（外來抗原）的結(jié)合。 OKT3的選擇性好、特異性強(qiáng)，制劑和療效較穩(wěn)定，對急性排斥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)率可達(dá)8595%。 第28頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 作業(yè)1、名詞解釋： 抗原、抗體、單克隆抗體。2、簡述單克隆抗體的制備原理。3、簡述單克隆抗體制備的基本過程。第29頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三4.3 鼠源性單克隆抗體的改造 雜交瘤單克

16、隆抗體均為鼠源性大量應(yīng)用于人體可產(chǎn)生人抗鼠抗體改造鼠源性單克隆抗體的目的：降低免疫原性降低相對分子質(zhì)量，增加組織通透性 第30頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三一、免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下增殖分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫蛋白-Ab?？贵w也稱為球蛋白。1968年和1972年將具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)一命名為免疫球蛋白。 第31頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三免疫球蛋白分為分泌型（SIg）和膜型（mIg）。SIg主要存在于血清及其他體液或外分泌液中，具有抗體的各種功能。mIg是B細(xì)胞表面

17、的抗原識別受體。Ig是由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈）通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。 第32頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三重鏈的分子量約為5075kD，由450550個氨基酸殘基組成。重鏈恒定區(qū)的氨基酸的組成和排列順序不同，其抗原性也不同。據(jù)此將免疫球蛋白分為五類，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應(yīng)的重鏈分別為鏈、鏈、鏈、鏈和鏈。根據(jù)Ig鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)目和位置的差別，同一類Ig可分為不同的亞類。 第33頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三輕鏈的分子量約25 kD，由214個氨基酸殘基構(gòu)成。輕

18、鏈分為(kappa)型和(lambda)型。天然Ig分子上兩條輕鏈的型別總是相同。 兩型輕鏈的功能無差異。 不同種屬中，兩型輕鏈的比例不同。:比例的異?？赡芊从趁庖呦到y(tǒng)的異常 -人類免疫球蛋白鏈過多，提示可能有產(chǎn)生鏈的B細(xì)胞腫瘤。 第34頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三可變區(qū) ：重鏈和輕鏈靠近N端的約110個氨基酸的序列變化很大。 高變區(qū) ：VH和VL各有三個區(qū)域的氨基酸組成和排列順序特別易變化。 互補(bǔ)性決定區(qū)：三個高變區(qū)共同組成Ig的抗原結(jié)合部位，該部位形成一個與抗原決定簇互補(bǔ)的表面。骨架區(qū)：高變區(qū)之外區(qū)域的氨基酸組成和排列順序相對不易變化。第35頁，共95頁，20

19、22年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三恒定區(qū)：重鏈和輕鏈的C區(qū)分別稱為CH和CL 。鉸鏈區(qū)：位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，易伸展彎曲，易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。 第36頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三二、免疫球蛋白的功能區(qū) VH和VL是結(jié)合抗原的部位。 HVR（CDR）是V區(qū)中與抗原表位互補(bǔ)結(jié)合的部位。 CH和CL具有部分同種異型的遺傳標(biāo)志。 第37頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三三、免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶水解片段。2個Fab段：抗原結(jié)合片段，由一條完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1功能區(qū)組成，與抗原結(jié)合不能形成凝集

20、反應(yīng)或沉淀反應(yīng)。Fc段：可結(jié)晶片段。Fc段相當(dāng)于IgG 的CH2和CH3功能區(qū)，無抗原結(jié)合活性，是抗體分子與效應(yīng)分子和細(xì)胞相互作用的部位。Ig同種型的抗原性主要存在于Fc段。第38頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三胃蛋白酶水解片段：雙價 F(ab)2片段：與抗原結(jié)合可發(fā)生凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)。 pFc： Ig的Fc段被胃蛋白酶裂解為若干小分子片段，失去生物學(xué)活性。 白喉抗毒素、破傷風(fēng)抗毒素經(jīng)胃蛋白酶消化后精制，因去掉Fc段而減緩發(fā)生超敏反應(yīng)。 第39頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三J鏈漿細(xì)胞合成； 富含半胱氨酸的一條多肽鏈；連接Ig 單體形成二聚

21、體、五聚體或多聚體。 第40頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三四、免疫球蛋白的生物學(xué)活性 識別并特異性結(jié)合抗原； IgM、IgG與抗原結(jié)合后，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生多種效應(yīng)功能：結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體； 調(diào)理作用 ：抗體、補(bǔ)體促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌等顆粒性抗原的作用； 第41頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三ADCC ：抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。表達(dá)Fc受體的細(xì)胞通過識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細(xì)胞； NK細(xì)胞是介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞。 第42頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三介導(dǎo)型超敏反應(yīng)：IgE的

22、Fc段與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和力IgE Fc受體結(jié)合，促使這些細(xì)胞合成和釋放生物活性物質(zhì)。穿過胎盤和粘膜： IgG是唯一能通過胎盤的免疫球蛋白； 是一種重要的自然被動免疫機(jī)制，對于新生兒抗感染具有重要意義。 第43頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三五、抗體的治療應(yīng)用抗腫瘤抗感染抗器官移植排斥反應(yīng)治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病第44頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三六、McAb藥物迅速發(fā)展的主要障礙人體免疫系統(tǒng)對鼠源蛋白的排斥反應(yīng)?？贵w人源化是解決問題的唯一途徑降低相對分子量，增加組織通透性。第45頁，共95頁，2022年，5月20

23、日，13點(diǎn)29分，星期三細(xì)胞工程雜交瘤技術(shù)鼠單抗人單抗大鼠小鼠產(chǎn)量高、操作比小鼠麻煩 少用易操作、多用HAMA反應(yīng)人人雜交瘤人B細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞融合人鼠雜交瘤人B細(xì)胞、鼠骨髓瘤細(xì)胞融合EBV轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞 單純轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后融合與鼠骨髓瘤與人鼠雜交瘤雜交瘤制備人單抗的問題：染色體易丟失、抗體分泌不穩(wěn)定第46頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 利根川進(jìn)（1980）報告了B細(xì)胞分化發(fā)育過程中抗體基因結(jié)構(gòu)的變化，闡明IgV區(qū)基因的重排與突變構(gòu)成無限組合，推測抗體多樣性達(dá)109-1011。4.3 基因工程抗體和抗體工程 一、抗體基因多樣性第47頁，共95頁，2022年，5月20日，1

24、3點(diǎn)29分，星期三二、基因工程抗體及其制備 目的：一是降低免疫原性；二是降低相對分子量，增加組織通透性。 原理：抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），異種抗原性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。 1、人-鼠嵌合抗體（chimeric antibody）：在基因水平上把鼠源性單克隆抗體的H和L鏈的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H鏈和L鏈的C區(qū)基因連接，即成為人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)出完整的Chimeric Antibody. 第48頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三第49頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期

25、三2、改形抗體(Reshaping antibody)：Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)性決定區(qū) (CDR區(qū))。如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中的CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。這種改型抗體也稱CDR移植抗體 。早期的改形抗體：簡單的CDR移植，通過點(diǎn)突變進(jìn)行“微調(diào)”即更換某個位點(diǎn)上的氨基酸。 第二代改形抗體：使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體。 第50頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三3、小分子抗體：基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子質(zhì)量僅

26、為原抗體的1/80-1/3。Fab片段抗體：VH+CH1+L。 FV抗體：VH+VL。單鏈抗體：VH-Linker-VL。單域抗體：VH或VL。最小識別單位：單個CDR區(qū)。第51頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三單鏈抗體 人工合成一段DNA片段，以VL-銜接物-VH的順序連接上VL和VH的DNA序列，構(gòu)成嵌合基因； 在大腸桿菌中表達(dá)，純化；單鏈蛋白具有抗體結(jié)合親和性和特異性。 第52頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三單鏈抗體體積小，免疫原性較低，滲透性好，能有效地穿透致密的腫瘤屏障，有利于實(shí)體瘤的診斷和治療。構(gòu)建雙功能分子 -生物導(dǎo)彈 單鏈抗體是

27、“導(dǎo)航系統(tǒng)”； 藥物蛋白是“炸彈” 。第53頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三4、多功能抗體及其制備1）雙功能抗體：雙特異性單鏈抗體，是一種非天然性抗體，其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性。如一個Fab片段結(jié)合腫瘤特異性抗原，另一個則結(jié)合殺傷性T細(xì)胞，識別和消滅腫瘤細(xì)胞的功能統(tǒng)一在一個單鏈抗體分子上。2）多功能抗體：結(jié)合性能良好的單鏈抗體的多聚體。3）抗體融合蛋白：從廣義講應(yīng)屬于雙功能抗體范疇。第54頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三小結(jié)：單抗研發(fā)的演變歷程鼠單抗100% 鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠/人崁合單抗(66-75 %

28、人源)ReoPro, RituxanRemicadeSimulect人源化單抗(90-95 % 人源)Zenapax, Mylotarg, Herceptin, CampathSynagis100% 人源 第55頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三用SCID小鼠制備人單抗SCID小鼠移植入人淋巴細(xì)胞 （人鼠嵌合模型）抗原免疫雜交瘤技術(shù)基因工程人單抗第56頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三人抗體鼠將小鼠Ig基因滅活然后轉(zhuǎn)入人Ig基因，生產(chǎn)出人單抗遺傳工程鼠第57頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 最理想的單克隆抗體：100%人

29、源；人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生。 全人抗體面臨的關(guān)鍵問題：抗體分泌細(xì)胞的保持。 第58頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三25年來的全人抗體的嘗試鼠骨髓瘤不適合與人B細(xì)胞融合 穩(wěn)定性差 抗體產(chǎn)量低 非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒 (EBV) 保存抗體分泌細(xì)胞細(xì)胞株不穩(wěn)定抗體的產(chǎn)量低不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株第59頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 全人抗體技術(shù)的最新突破 成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系Karpas707H ，人源抗體進(jìn)入新的里程用 途：能穩(wěn)定的保持人B細(xì)胞分泌抗體的能力發(fā)明人：英國劍橋大學(xué)的Dr Karpas教授意 義：1 在整體水

30、平上研究人類產(chǎn)生的抗體 2 開創(chuàng)人類抗體基因組學(xué)的研究評 價：1 諾貝爾獎得主Dr Milstein 推薦發(fā)表在PNAS2 世界權(quán)威雜志“科學(xué)”發(fā)表了新聞評述3 劍橋大學(xué)開了新聞發(fā)布會第60頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 基因工程抗體，即按不同的需要，將抗體的基因進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后再導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的抗體分子，這也就是第三代抗體。第61頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三基因工程抗體具有的優(yōu)點(diǎn) 通過基因工程技術(shù)的改造，可降低甚至消除人體對抗體的排斥反應(yīng)；基因工程抗體的分子量較小，可部分降低抗體的鼠源性，更加有利于穿透血

31、管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；根據(jù)疾病的類型和部位，制備新型抗體；可采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。 自1986年以來，北京安波特基因工程技術(shù)有限公司連續(xù)承擔(dān)四個五年期國家科技部“863”抗體類生物治療腫瘤藥物研究項(xiàng)目；目前已取得了國際、國內(nèi)首次發(fā)表的14項(xiàng)領(lǐng)先研究成果；申請了四項(xiàng)專利。 第62頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 四、噬菌體抗體庫技術(shù)phage antibody library定義： 通過PCR將全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因克隆出來，并在噬菌體表面表達(dá)、分泌，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。 第63頁，共95頁，202

32、2年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三1、在噬菌體中表達(dá)免疫球蛋白基因的原理 大腸桿菌絲狀噬菌體M13、fd、f1等，屬于絲桿噬菌體科、絲桿噬菌體屬，含一個單鏈環(huán)狀DNA分子；DNA外螺旋狀排列著5種外殼蛋白：蛋白位于絲狀噬菌體的管狀部分；蛋白、和分別位于兩端。常將外源基因與外殼蛋白的基因連接，形成融合蛋白。 第64頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三第65頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三2、重組噬菌體生產(chǎn)抗體從小鼠或人的B細(xì)胞中分離出mRNA；反轉(zhuǎn)錄成cDNA；設(shè)計(jì)兩對特殊的引物，通過PCR將編碼重鏈和輕鏈的cDNA擴(kuò)增出來；用特定的限制性內(nèi)切

33、酶酶解擴(kuò)增出來的cDNA片段；第66頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三cDNA片段克隆進(jìn)入絲狀噬菌體質(zhì)粒載體中，與單鏈絲狀噬菌體外殼蛋白或的基因連接形成融合基因；經(jīng)過輔助噬菌體感染后，抗體功能片段與外殼蛋白一起表達(dá)在重組絲狀噬菌體的表面；通過免疫親和層析的方法或用ELISA的方法，篩選出抗原特異性抗體。 第67頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三第68頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三3、組合抗體文庫技術(shù) 重鏈和輕鏈的cDNA都有各不相同的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)； 將每一序列（大量不同的抗體基因）都定向克隆進(jìn)一單獨(dú)的絲狀噬菌體

34、載體并在裂解循環(huán)中表達(dá)；形成一個可以用以篩選特異抗原結(jié)合活性的組合絲狀噬菌體文庫。 第69頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三第70頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三第71頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三哺乳動物的B細(xì)胞可以產(chǎn)生約106-108個不同的抗體；一個噬菌體文庫含有相同數(shù)量級的克??；因而一個抗體組合文庫可以包括任何一種哺乳動物B細(xì)胞產(chǎn)生的各種抗體分子；對混合文庫中的克隆可以進(jìn)行人工突變。 第72頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三4、噬菌體抗體文庫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)省去了單克隆抗體制備過程中許多費(fèi)時

35、費(fèi)力的過程； 使Ab的制備由細(xì)胞水平進(jìn)入到基因水平，為解決人源單克隆抗體的制備提供了新的途徑；重、輕鏈的隨機(jī)組合提高了抗體的多樣性。 第73頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三5、Ab蛋白的附著型和分泌型表達(dá)在絲狀噬菌體的外殼蛋白基因和外源抗體蛋白基因之間引入一個琥珀突變密碼子UAG； 當(dāng)絲狀噬菌體感染有琥珀突變抑制的大腸桿菌株(如SupE)時，UAG密碼子被解讀為G1u，Ab蛋白就以融合蛋白的形式附著于噬菌體表面；在非琥珀突變抑制的大腸桿菌菌株中表達(dá)時，UAG密碼子被解讀為終止密碼子，Ab蛋白以可溶性蛋白的形式被分泌到細(xì)菌體外。 第74頁，共95頁，2022年，5月20

36、日，13點(diǎn)29分，星期三第75頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三6、抗體的表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)哺乳動物細(xì)胞是真核細(xì)胞；具有對表達(dá)的蛋白進(jìn)行正確的加工和翻譯后修飾的能力；可以將抗體分泌表達(dá)。 第76頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三細(xì)菌表達(dá)生產(chǎn)抗體分子片段最為有效的系統(tǒng) 表達(dá)的抗體分子不能糖基化、組裝錯誤、不能形成正確的二硫鍵等易形成不溶且不具活性的蛋白包涵體酵母、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞第77頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三7、隨機(jī)多肽文庫 又稱人工合成抗原決定簇文庫 人工合成構(gòu)建編碼隨機(jī)肽段(一般在69肽之間)的基因；

37、 噬菌體展示 ,構(gòu)建一個多肽文庫； 從文庫中篩選能夠模擬某些生物大分子生物功能與活性的短肽小分子。 第78頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三EPO模擬小肽 隨機(jī)合成8肽文庫；通過ELISA的方法，用EPO受體篩選； EPO模擬肽段的功能完全可以模擬EPO分子。 第79頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)和體外均可呈顯某種反應(yīng)。在體內(nèi)，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應(yīng)條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應(yīng)，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學(xué)診斷和血型測定，稱為血

38、清學(xué)鑒定。一、抗體診斷試劑 抗體診斷藥物基本分為三類：血清學(xué)鑒定用的和免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體制劑，以及體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物。4.4 抗體藥物第80頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三1、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑 A、常用診斷血清的品種和用途 B、診斷血清的制備步驟 a、制備細(xì)菌抗原：細(xì)菌接種-培養(yǎng)-收集菌苔-制成菌液。 b、免疫動物和制備抗體血清：動物：家兔、馬、羊、豚鼠。免疫途徑：靜脈、腹腔、皮下。接種次數(shù)3-7次，每次間隔3-4d，末次注射后6-8d取血樣測效價，達(dá)到要求，即可采血，離心分離血清。 C、診斷血清的診斷方法：直接凝集反應(yīng)。第81頁，

39、共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三（2）HBsAg的反向被動血凝診斷試劑A、試劑制備原理：紅細(xì)胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質(zhì)，當(dāng)純化的抗HBs血清吸附其上時便具有抗體活性，若待測樣品中存在有HBsAg時，則發(fā)生特異性結(jié)合而使血細(xì)胞發(fā)生凝集。B、制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠-獲得抗HBs血清-硫酸銨鹽析/柱層析-取其 IgG -在pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細(xì)胞-洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。C、診斷方法：在V型血凝板上進(jìn)行，陰性樣品不凝集，少許血細(xì)胞沉積于V型孔底部，呈尖點(diǎn)狀；陽性樣品血細(xì)胞凝集成塊狀。第82頁，共95頁

40、，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三（3）妊娠診斷試劑 婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG(絨毛膜促性腺激素)含量增高，在3個月內(nèi)可達(dá)到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷孕。（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清第83頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三2、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進(jìn)行定性定量測定，靈敏度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機(jī)制提供手段。（1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫

41、氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷和定位的目的。 第84頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三（2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標(biāo)診斷試劑 a、HBsAg酶標(biāo)診斷試劑 b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標(biāo)診斷試劑 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標(biāo)診斷試劑 d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo) 診斷試劑 e、AFP（甲胎蛋白）酶標(biāo)診斷試劑 f、CEA（癌胚抗原）酶標(biāo)診斷試劑第85頁，共95頁，2022年，5

42、月20日，13點(diǎn)29分，星期三（3）放射免疫用抗體診斷試劑 把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點(diǎn)結(jié)合起來建立的檢測技術(shù)。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。A、HBsAg 125I 標(biāo)記抗體診斷試劑:靈敏度0.1ng/ml；B、HBeAg 125I 標(biāo)記抗體診斷試劑:靈敏度0.1ng/ml；C、HAV抗原125I 標(biāo)記抗體診斷試劑；D、AFP 125I 標(biāo)記抗體診斷試劑:靈敏度1-5ng/ml；E、CEA 125I 標(biāo)記抗體診斷試劑:，靈敏度1ng/ml。第86頁，共95頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三3、導(dǎo)向診斷藥物 腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中導(dǎo)向診斷藥物在臨床上沒有廣泛應(yīng)用腫瘤放射免疫顯像為