基因工程中常用的酶課件

1、第二章 基因工程中常用的酶 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 (Restriction enzyme) 一. 限制與修飾: 1962年 Arber, W(瑞士).等 提出限制與修飾假說。 1968 Arber 等發(fā)現(xiàn)型限制性酶。 1968 Smith和Wilcox K.W.發(fā)現(xiàn)了類限制性酶 并闡明其性質(zhì)。 1971 Nathans等首次制作酶切圖譜。 因他們發(fā)現(xiàn)了限制性酶并應(yīng)用于分子遺傳學(xué)而獲1978年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。1962 , Arber, 1968 Smith 發(fā)現(xiàn)限制性酶 W. Arber (1929 ) H. O. Smith (1931 ) Biozentrum der Unive

2、rsitt Basel, Johns Hopkins University School Switzerland of Medicine,USA 二.限制性內(nèi)切酶的類型四.同裂酶(isoschizomers): 切割同一靶序列而來源不同的酶。 Mbo I : GATC GATC CTAG CTAG Bam HI : G GATCC CCTAG G G GATCC CCTAG G第二節(jié) 分子克隆中常用的酶一.連接酶 (DNA ligase) 在E.coli和動植物細(xì)胞中都有此酶。能催化DNA 中相鄰的3-OH和5-P之間形成磷酸二脂鍵。 二.甲基化酶(methylase)可使DNA甲基化。有兩種

3、： dam 甲基化酶和dcm甲基化酶 N6A甲基化 5GmATC3 C5C甲基化 CmCAGG 或 CmCTGG 用途：保護待克隆的片斷。 例如構(gòu)建真核DNA文庫時用E.coli甲基化酶修飾DNA片斷中的EcoRI酶切位點，然后將修飾的片斷與人工EcoRI接頭連接，接頭用EcoRI切割后，將DNA片斷插入噬菌體DNA中。三.DNA聚合酶I(DNA lolymerase I )DNA pol I 單鏈多肽，MW109kD,可被枯草桿菌蛋白酶切成兩段；C-端大片斷(Klenow 酶)，MW76kD,具53聚合酶和3 5外切酶活性，N-端小片斷MW36kD,具53外切酶活性。 (一)聚合酶活性： M

4、g2+ DNA ndNTP DNA(pdN)n+nPPi 5 CCGOH Mg2+ 5 CCGATACC 3GGCTATGG 3GGCTATGG(二)外切酶活性(2) 53外切酶活性: 切補作用 從游離的5端降解DNA，對DNA雙鏈部分的磷酸二脂鍵有切除功能，每次切10nt 5 CGCATCT Mg2+ 5 CATCT 3GCGCGTAGA 3GCGCGTAGA(3) 3 5外切酶活性: 校對作用從游離的5端降解dsDNA和ssDNA 5CGCATCT Mg2+ 5CGC 3GCG 3GCG四 .末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 取自小牛胸腺,催化脫氧核苷酸與DNA的 3

5、-OH結(jié)合 模板/引物或底物是帶有3-OH基的ssDNA或帶有突出的雙鏈DNA。不要求模板。 Mn2+ 或Mg2+ ssDNAOH+ndNTP DNA-(pdN)n+nppi Co2+ dsDNAOH+ndNTP DNA- (pdN)n+nppi用途：(1)在載體和cDNA上加互補的同聚物接頭(Homopolymeric tail) AAAAA AAAAA TTTTT TTTTT(2) 用32P進行3端同位素標(biāo)記 六. 核酸酶S1(nuclease S1)從米曲霉(Aspergillus oryzae)中提純得到的一種金屬蛋白，是單鏈特異性核酸酶。 ssDNA or ssRNA pH4.5 Z

6、n2+ 5pdN 5prN中等量的酶會在缺口或 small gaps切斷dsDNA pH4.5 Zn2+用途：(1)分析RNADNA雜合結(jié)構(gòu)；(2)除去DNA的單鏈末端，生成平端；(3)切斷雙鏈DNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。七.核酸酶 Bal 31具兩種活性：(1)雙鏈特異外切酶活性；從dsDNA的3和5切除寡核苷酸或單核苷酸；EGTA(乙二胺四乙酸) 可終止反應(yīng)(2)單鏈特異內(nèi)切酶活性：專門從單鏈DNA切除帶有5末端的單鏈核苷酸和寡核苷酸(類似于核酸酶S1的單鏈特異性核酸內(nèi)切酶活性) Ca2+ Ca2+ Ca2+ 用途：1.切除dsDNA的末端核苷酸，使DNA的分子變小，在T4連接酶的作用下連接接頭和載體。2.繪制DNA的限制圖譜。 Bal31與限制性內(nèi)切酶協(xié)同作用可繪制物 理圖譜.還可逐步縮短D