原核生物的基因表達(dá)與操作課件

1、重組基因的原核生物表達(dá)體系與產(chǎn)物的分離純化目的基因 載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA基因克隆的技術(shù)路線重組基因表達(dá)的目的 1. 蛋白質(zhì)功能研究 2. 生物制藥和疫苗生產(chǎn) 3. 疾病的基因治療 4. 食品、化工用酶制劑 5. 抗蟲、抗逆植物改良 6. 細(xì)胞代謝產(chǎn)物的富集重組基因表達(dá)體系1. 原核體系2. 真核體系 大腸桿菌枯草桿菌乳酸菌沙門氏桿菌蘇云金桿菌酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞植物細(xì)胞、組織動(dòng)物細(xì)胞、組織大腸桿菌中表達(dá)體系的不足：1. 真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很 大的差別。2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。細(xì)菌的 RNA聚合酶不能識(shí)別真

2、核的啟動(dòng)子；外源基因 可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷 酸序列。3. 真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異， 影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過 轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝）， 而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中 并不存在；5. 細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來的真核基 因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。 啟動(dòng)子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列) 終止子 選擇標(biāo)記基因 復(fù)制子 原核生物基因表達(dá)載體的組成特征 啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止子大腸桿菌表達(dá)載體報(bào)告基因（reporter gene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單元（半乳

3、糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動(dòng)子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測啟動(dòng)子功能的依據(jù)。大腸桿菌的Lac啟動(dòng)子 來自大腸桿菌的乳糖操縱子 由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動(dòng)基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)基因所組成 受活化蛋白和cAMP 的正調(diào)控，阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（鄰硝基苯基半乳糖苷）的誘導(dǎo)LacUV5啟動(dòng)子：Lac啟動(dòng)子的衍生物大腸桿菌的trp啟動(dòng)子

4、來自大腸桿菌的色氨酸操縱子由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因及trpE的部分結(jié)構(gòu)基因組成受阻遏蛋白和衰減子的調(diào)控，阻遏蛋白前體必須與色氨酸結(jié)合才有活性 3-吲哚丙烯酸（IAA）可競爭性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)錄活性。 噬菌體的左向啟動(dòng)子PL來自噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，活性比Trp啟動(dòng)子高約11倍；受控于溫度敏感的阻遏蛋白cI 。在低溫(28-30)時(shí)，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫(42)時(shí)，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體1）強(qiáng)啟動(dòng)子: tac（trp-lac） 2）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng) trp

5、的-35區(qū) lacUV5的-10區(qū) lac操縱基因 常用大腸桿菌表達(dá)載體 3）表達(dá)誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會(huì)被降解） 條件： 必須選擇一個(gè)有l(wèi)acI的宿主菌。非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。 所表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。 非融合蛋白特點(diǎn)： 表達(dá)時(shí)要求高：SD序列與ATG的距離要 合適。即使改變2-3個(gè)堿基，表達(dá)效率也 會(huì)大受影響。 優(yōu)點(diǎn)：能夠較好地保持原來蛋白的活性。 缺點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)容易被蛋白酶降 解，蛋白產(chǎn)量低；分離純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 成本較高。2. 分泌型表達(dá)載體 載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信

6、號(hào)肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 1）強(qiáng)啟動(dòng)子：Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子。 2）調(diào)節(jié)基因：lac I 。3）S-D序列和起始密碼ATG。 4）分泌信號(hào)肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)）。 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建的三個(gè)原則： 首先，受體細(xì)菌結(jié)構(gòu)基因應(yīng)能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化。 其次，外源基因應(yīng)插在受體菌結(jié)構(gòu)基因的下游區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定了融合

7、蛋白的裂解方法。 最后，當(dāng)兩個(gè)蛋白編碼序列融合在一起時(shí)，外生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來pGEX-2X的插入?yún)^(qū)pGEX-1X的插入?yún)^(qū)pGEX-3X的插入?yún)^(qū)4.其他融合蛋白系統(tǒng) His-tag（組氨酸標(biāo)簽） 在外源多肽的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（His）。 His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質(zhì)有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。

8、 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞周質(zhì)細(xì)胞外表達(dá)產(chǎn)物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是： 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單； 能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì) 胞總蛋白的20%40%。 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種： 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借 助于身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最 終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。包涵體蛋白 本質(zhì)：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集 包括：1.折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用

9、； 2.非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用； 3.蛋白質(zhì)的中間體結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點(diǎn)：易于分離純化 在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集 簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分， 菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來 能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn) 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生 物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收 率至關(guān)

10、重要。 經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性， 有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys 殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過 30% 復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn) 分離純化細(xì)菌包涵體蛋白質(zhì)的基本步驟： 破碎細(xì)胞 (Disruption of cell) 分離包涵體 (Seperation of inclusion body) 溶解包涵體 (Dissolve inclusion body) 蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)象復(fù)原等。 (Recovery of target protein conformation)包涵體

11、的復(fù)性前準(zhǔn)備洗滌：由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。包涵體的溶解 1.采用高濃度的變性劑，使其形成伸展的肽鏈。常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GuaHCl 6-8M），通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，異氰硫酸胍（GuaSCN）最強(qiáng)。 變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：一般在偏堿性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。有些蛋白

12、只能用鹽酸胍。增溶時(shí)一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。2.去垢劑：如強(qiáng)的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶幾乎所有的蛋白。但由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用（研究）。 3.極端pH：可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。如在pH9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。 4.還原劑：由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM DTT，也有使用5mM濃度。實(shí)際，還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，

13、而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入金屬螯合劑EDTA去除金屬離子。(伸展態(tài))U(中間態(tài))I(自然態(tài))N A（包涵體） 從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢。當(dāng)溶液中離子強(qiáng)度或變性劑濃度很低，又無其它輔助手段存在時(shí)，聚集趨勢占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。 蛋白質(zhì)折疊的三態(tài)模型復(fù)性目的 復(fù)性：通過緩慢去除變性劑（避免折疊中間體重新聚集）使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)（？）恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑

14、使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。 蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一個(gè)蛋白質(zhì)都有一個(gè)最佳的復(fù)性條件，只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進(jìn)一步的層析分離得以順利完成。 包含體蛋白復(fù)性方法幾個(gè)要求：活性蛋白的回收率高正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤的折疊蛋白質(zhì)分離。折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品復(fù)性過程耗時(shí)少復(fù)性常用方法 1.稀釋復(fù)性：直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺點(diǎn)是體積增加較大，后續(xù)處理困難。

15、稀釋蛋白濃度：濃度高則容易形成聚集體（較低的復(fù)性收率）。有時(shí)需低于0.01mg/mL。 脈沖流加復(fù)性：分批次加入到緩沖液中，使折疊中間體保持在較低的水平。例：在5-10mg/mL終濃度下，溶菌酶復(fù)性收率可達(dá)80%以上。 2.透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。 3. 超濾復(fù)性：選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)通不過。在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性（蛋白聚集于膜上）。4.色譜復(fù)性：輔助手段，兼具分離。 4.1 凝膠過濾復(fù)性：除了蛋白

16、質(zhì)在膠粒中傳質(zhì)和擴(kuò)散外，蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間并沒有發(fā)生其他作用。該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對(duì)較慢，對(duì)有些蛋白質(zhì)的復(fù)性有利。 4.2 吸附型層析復(fù)性：離子交換、疏水層析、親和層析和擴(kuò)張床層析均屬于吸附層析。其基本復(fù)性原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝膠介質(zhì)上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復(fù)性緩沖液將吸附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成復(fù)性。Solid-Phase (or Matrix-assisted) Refolding IB inE. coliIB(solid)Solubilized IB(unfolded)Aggregat

17、eRefolded Bioactive monomerRefoldingSolution-stateFSolid SupportFunctional GroupSolid-state refoldingRemove DenaturantF 5.分子伴侶：主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰一輔氨酰順反異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。 體內(nèi)復(fù)性主要是在工程菌培養(yǎng)過程中同時(shí)加入分子伴侶的基因進(jìn)行共表達(dá)；體外復(fù)性主要是將基因工程菌中包涵體溶解，再加入分子伴侶幫助折疊。復(fù)性過程中的添加劑 低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折

18、疊，但可能通過破壞錯(cuò)誤折疊中間體的穩(wěn)定性或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)性產(chǎn)率?？煞乐共豢赡婢奂w的出現(xiàn)。 鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是有效的促進(jìn)劑。 In-Vitro Refolding PathwaySSSSUnfoldedAggregateIntermediate(molten globular)3D Structure(Bioactive)SSSSCorrectly FoldedIntramolecularMisfoldingSSSSSSSSSSSSIntermolecularMisfoldingStandard IB Renaturation Pr

19、ocess Cell DisruptionRefoldingPost-refolding purification stepIB IsolationIB WashingSolubilizationCentrifugation Remove Cell DebrisDenaturantPartial Removal of DenaturantComplete Removal of DenaturantIBDissolved Refolding包涵體分離純化過程61細(xì)胞培養(yǎng)收獲細(xì)胞細(xì)胞破碎離心5 - 10 000g沉淀物沖洗和離心分離包涵體親和純化和復(fù)性溶解包涵體 - 細(xì)胞破碎, 沖洗和分離每 10

20、0 ml 培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞沉淀物於 4 ml 20 mM Tris -HCl pH 8.0 在冰浴情況下，用超聲震蕩破碎細(xì)胞，并在+4C下高速離心 10 分鐘重新懸浮細(xì)胞沉淀物於 2 ml 含 e.g. urea 的沖洗緩沖液和再度超聲震蕩并在+4C下高速離心 10 分鐘用沖洗緩沖液沖洗細(xì)胞沉淀物622 M UREA20 mM Tris HCl2% Triton X1000.5 M NaCl溶解和準(zhǔn)備樣品重新懸浮細(xì)胞沉淀物於 5 ml 溶解緩沖液 (e.g.):20 mM Tris -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 鹽酸胍,1 mM 2-巰基乙醇pH 863在室溫等

21、 30-60 分鐘在+4C 離心 15 分鐘用 0.22 m 或 0.45 m 濾膜過濾載體和標(biāo)記純化pGEX谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 GST MicroSpin Purification Module,GSTrap, Glutathione Sepharose Fast FlowPQE6 x 組氨酸His MicroSpin Purification ModulepETHisTrap, HiTrap Chelating, 6 x組氨酸Chelating Sepharose Fast FlowpEZZ 18 (非誘導(dǎo)性表達(dá)) 蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast

22、FlowpRIT2T (利用溫度改變誘導(dǎo))蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast Flow親和層析純化65GST 融合蛋白的純化GST重組蛋白 酶切位點(diǎn)Factor Xa:Mr 17-20 000 / 28-30 000Thrombin: Mr 37 000PreScission Protease:Mr 46 000Glutathione Sepharose Mr 26 00010C66SDS PAGE analysis020406080100% Elution buffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0ml minW

23、ashElutionbuffer2.7 mg pure GST fusion protein5.010.015.020.0A280kD9414.420.13043671 2 3柱:GSTrap 1 ml樣品:8 ml 大腸桿菌表達(dá)含 GST 融合蛋白胞漿萃取液結(jié)合緩沖液:PBS, pH 7.3洗脫緩沖液50 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM 還原谷胱甘肽流速:1 ml/min層析 步驟:4 CV結(jié)合緩沖液, 8 ml 樣品, 10 CV結(jié)合緩沖液, 5 CV洗脫緩沖液, 5 CV結(jié)合緩沖液(CV = 柱體積) 系統(tǒng):KTAexplorer 101:低分子量標(biāo)記 (LMW) C

24、alibration kit, 還原, Amersham Pharmacia Biotech2:胞漿萃取液, 1 g /10 ml3:洗脫GST 融合蛋白67(His)6 融合蛋白的純化和檢測重組蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+69SDS PAGEFlow through加樣結(jié)合液洗脫液結(jié)合液AA280280AA4054051.00.50.00.700.600.500.400.300.200.100.05.010.015.020.0Volume (ml)ElutedpoolWashkDa94.067.043.020.114,41 2 3 4 5 6 7 8樣品:5 ml大腸桿菌表達(dá)含(His)-標(biāo)記谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，GST-(His)6柱:HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+結(jié)合緩沖液:1X 磷酸緩沖液, 20 mM 咪唑 pH 7.4洗脫緩沖液:1X 磷酸緩沖液, 500 mM咪唑 pH 7.4流速: 2 ml/min, 312 cm/h結(jié)果:洗脫 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 總量: 4.46 mg1:低分子量標(biāo)記 (LMW) 2:樣品稀釋 1:203:穿透稀釋 1:104:沖洗液5:洗脫 GST-(H