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文檔簡介
1、第八章 聚合酶鏈反應(yīng) 1985年P(guān)E-cetus公司的人類遺傳研究室Mullis等人發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)。此技術(shù)能夠特異地擴增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)、法醫(yī)、考古等方面有重要的應(yīng)用價值,并對分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展給予巨大的推動。第一節(jié) PCR原理與特點第二節(jié) PCR類型第三節(jié) PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一、PCR的基本原理 在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件模板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間等,使目的DNA得以迅速擴增(圖8-1
2、)。 DNA模板變性 雙鏈DNA是通過94左右的高溫使其發(fā)生變性,形成單鏈DNA。 模板與引物退火 將合成的兩個寡核苷酸引物分別與待擴增DNA兩端的序列互補。通過控制退火條件,引物就能準(zhǔn)確地與擴增區(qū)域的兩端配對。 引物延伸 在4種dNTP底物及Mg2+存在條件下,DNA聚合酶在最適作用溫度可將單核苷酸從引物3端摻入,沿模板延伸合成新股DNA,每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一循環(huán)的模板。 以上所述的變性、退火、延伸“三步曲”被確定為PCR的一輪循環(huán),整個PCR過程一般需進行三十輪的循環(huán)。 按2n的指數(shù)方式遞增, PCR擴增量應(yīng)達到230個拷貝, “平臺效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早主要取決于起始模板的拷貝數(shù)、所用的D
3、NA聚合酶的性能及底物dNTP的濃度等多種因素。 二、PCR技術(shù)的特點 高度的敏感性 PCR產(chǎn)物的生成是以指數(shù)方式增加的,即使按75%的擴增效率計算,單拷貝基因經(jīng)25次循環(huán)后,其基因拷貝數(shù)也在100萬以上,即可將極微量(pg級)DNA擴增到紫外光下可見的水平(g級)。 高度的特異性 PCR擴增的特異性在很大程度上依賴于引物與模板的互補程度,即引物與模板結(jié)合的正確性。 操作簡便、快速 適用樣品廣泛 含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的樣品即可用作反應(yīng)的起始材料。 三、常規(guī)的PCR操作 反應(yīng)體系 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體積為50100l,其中含有:1PCR反應(yīng)緩沖液、四種dNTP (dATP、dCTP
4、、dGTP、dTTP)、二種上、下游引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶。 反應(yīng)步驟四、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 模板核酸 PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的擴增需首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進行正常PCR循環(huán)。 引物 引物是指與待擴增靶DNA兩端序列互補的寡核苷酸,兩段引物分別與相應(yīng)的一條DNA鏈3端及5端互補。引物設(shè)計一般遵循下列原則:(1)引物的序列應(yīng)選定基因組DNA的高度保守區(qū),以減少引物與基因組的非特異結(jié)合,提高反應(yīng)的特異性。(2)引物的長度以1540bp為宜。 (3)引物的堿基盡可能隨機分布,避免出現(xiàn)數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,G+C堿基的含量在40%75%之間。(4)
5、 引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu),特別是引物的末端應(yīng)無回文結(jié)構(gòu)。(5) 二個引物之間不應(yīng)有互補序列,以免形成“引物二聚體”,浪費引物。(6)引物5末端堿基無嚴(yán)格限制,在與模板結(jié)合的引物長度足夠的條件下,其5端堿基互補程度無嚴(yán)格限制。(7) 引物3端的頭12個堿基會影響Taq DNA聚合酶的延伸效率,從而影響PCR反應(yīng)的擴增效率及特異性,因此選擇合適的3端堿基很重要。最好選T、C、G,不選A (8)引物的3端應(yīng)為保守氨基酸序列,即采用簡并密碼少的氨基酸如Met、Trp,且要避免三聯(lián)體密碼第3個堿基的擺動位置位于引物的3末端。 耐熱DNA聚合酶 Taq DNA酶有良好的熱穩(wěn)定性,Taq DNA聚合酶在
6、7075時具有最高的生物學(xué)活性。 脫氧核苷三磷酸 脫氧核苷三磷酸(dNTP)是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的總稱,是靶DNA序列擴增的原料。dNTP濃度取決于擴增片段的長度、MgCl2濃度、引物濃度等反應(yīng)條件。 緩沖液 目前最為常用的緩沖液體系為1050mmol/L Tris-HCl (pH 8.38.8,20)。 Mg2+ Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降;Mg2+濃度過高則影響PCR反應(yīng)的特異性。 添加劑 PCR反應(yīng)中加入一定濃度的添加劑如DMSO (二甲基亞砜)等可提高PCR擴增效率及特異性 PCR循環(huán)數(shù) 30次是比較合理的循環(huán)次數(shù),循環(huán)次數(shù)太少,產(chǎn)物的量不
7、多;循環(huán)次數(shù)過多,則非特異性產(chǎn)物增加。 PCR易發(fā)生的問題及解決方法沒有得到所希望的PCR產(chǎn)物(假陰性)所有樣品均為陽性(假陽性)PCR產(chǎn)物呈片狀出 現(xiàn)非特異擴增 第二節(jié) PCR類型一、不對稱PCR(asymmetric PCR) 不對稱PCR的目的是擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。PCR反應(yīng)中采用二種不同濃度的引物,PCR結(jié)果產(chǎn)生大量單鏈DNA。因PCR反應(yīng)中使用的二種引物濃度不同一步法,因此稱不對稱PCR,此法產(chǎn)生的單鏈DNA可用作雜交探針或DNA測序的模板。 進行不對稱PCR有二種方法:(1) 一步法;(2) 兩步法,第一次PCR用等濃度的引物,以期獲得較多的目的DNA片段,取第一次擴增產(chǎn)
8、物(含雙鏈PCR片段)用單引物進行第二次PCR擴增產(chǎn)生單鏈DNA。二、逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) RT-PCR先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板合成cDNA,再以cDNA為模板加入dNTP和兩種特異引物及Taq酶進行PCR反應(yīng),這樣低豐度的mRNA被擴增放大易于檢測。 RT-PCR中的關(guān)鍵步驟是RNA的逆轉(zhuǎn)錄,要求RNA模板必須是完整的,且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。三、錨定PCR(anchored PCR, A-PCR) 該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾,人為賦予未知基因末端序列信息,再用人工合成的與多聚尾互補的引物作為錨
9、定引物,在與基因配對互補結(jié)合后進行PCR擴增(圖8-2)。四、反向PCR (inverse PCR, IPCR)IPCR是擴增未知序列的一種簡捷方法。其基礎(chǔ)是:用限制性內(nèi)切酶消化DNA,然后環(huán)化切割的產(chǎn)物,再用切割后已知序列上兩端相反方向的引物序列進行PCR (圖8-3),也可將環(huán)化DNA線性化后再進行PCR。五、隨機引物PCR (arbitrary primer PCR, AP-PCR) RAPD建立在PCR基礎(chǔ)之上,它是利用一系列不同的隨機排列的寡核苷酸鏈(通常為十聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)EB染色來檢測擴增DNA片段多
10、態(tài)性??捎糜谶M行基因組指紋圖譜的構(gòu)建,并利用指紋圖譜進行品種鑒定和對物種進行親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化的研究。 六、差異顯示RT-PCR(differential display RT-PCR,DDRT-PCR) DDRT-PCR技術(shù)最大的優(yōu)點是省去了cDNA克隆和隨后繁雜的克隆篩選工作。但此方法也存在需要合成的引物多、費用大、操作技術(shù)要求高、虛假特異區(qū)帶出現(xiàn)較多等缺點,仍有待進一步完善。如圖8-4。七、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR (single strand construction polymor-phism PCR, SSCP-PCR) 其原理是單鏈DNA分子因單一核苷酸不同,其二級結(jié)構(gòu)有所差異,PC
11、R產(chǎn)物常表現(xiàn)在非變性凝膠電泳中電泳遷移率不同。通過比較DNA的電泳類型,即可測出突變。其優(yōu)點是所需樣品DNA量極少,靈敏度高,可檢測出點突變,以及插入、缺失突變,能一次篩選多個樣品。八、俘獲PCR 一種生物素標(biāo)記的同已知序列互補的引物首先通過線性擴增延伸。而后,生物素標(biāo)記的延伸產(chǎn)物,可被已包被鏈霉抗生素蛋白的固體支持物選擇性地俘獲。經(jīng)幾次洗滌,可去除所有未生物素化的DNA分子,經(jīng)過這一步純化,再進行指數(shù)擴增可大大降低非特異性擴增背景。九、多重PCR (multiplex PCR) 多重PCR是在同一反應(yīng)中采用多對引物同時擴增幾個不同的DNA片段;如果被測基因某一區(qū)段缺失,則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)
12、段PCR擴增產(chǎn)物長度減少或消失,從而發(fā)現(xiàn)基因異常(圖8-5)。多重PCR具有靈敏、快速特點,特別適用檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變,其結(jié)果與Southern雜交結(jié)果同樣可靠,且多重PCR尚可檢測小片段缺失。十、著色互補PCR (color complementation PCR) 該法的原理是用不同的熒光染料標(biāo)記不同引物的5端,如JoE、TAMRA及CouM等染料分別呈紅、綠、藍熒光。進行復(fù)合PCR,合成的目的DNA片段分別帶有引物5端染料的顏色以此來判定擴增產(chǎn)物的結(jié)果,若某一DNA區(qū)帶缺失,則無對應(yīng)染料標(biāo)記的產(chǎn)物,據(jù)此可判定基因異常或發(fā)現(xiàn)感染的病毒等。十一、巢居PCR (neste
13、d PCR, N-PCR) N-PCR是設(shè)計兩對引物,一對引物對應(yīng)的序列在模板的外側(cè),稱外引物(outer-primer),另一對引物互補序列在同一模板的外引物的內(nèi)側(cè),稱內(nèi)引物(inter-primer),即外引物擴增產(chǎn)物較長,含有內(nèi)引物擴增的靶序列,這樣經(jīng)過二次PCR放大可將單拷貝的目的DNA片段檢出。十二、半巢居PCR (heminested PCR, Hn PCR) Hn PCR是巢居PCR與不對稱PCR的結(jié)合,Hn PCR是先用等量的外引物擴增,再用一個內(nèi)引物擴增,產(chǎn)生大量單鏈內(nèi)引物的產(chǎn)物,Hn PCR比巢居PCR節(jié)省一個引物,又比不對稱PCR的特異性及敏感性好。十三、二溫式PCR 標(biāo)
14、準(zhǔn)PCR的一輪循環(huán)是由變性、退火、延伸三步組成的,在不影響PCR反應(yīng)特異性和敏感性前提下,可將退火、延伸溫度合并為一個溫度,采用二溫式PCR,即94變性,6568退火延伸,這樣既保證引物與模板結(jié)合特異性,又可使引物順利延伸,與標(biāo)準(zhǔn)PCR相比,二溫式PCR操作更簡便、快速、特別適于臨床檢驗。十四、增敏PCR (booster PCR, BPCR) 其基本方法是將標(biāo)準(zhǔn)PCR 30輪循環(huán)分兩次進行,第一次引物濃度僅為數(shù)十pmol/L,延長退火時間,進行20輪循環(huán)后,靶序列濃度大大提高,再將引物濃度增至0.1mol/L,同時縮短退火時間,再進行20輪循環(huán)。用BPCR檢測E coli BMI 195耐紅
15、霉素基因(ere A),可檢出糞便標(biāo)本中110個菌。十五、重組PCR 重組體的構(gòu)建(圖8-6所示) 它的原理在于巧妙地設(shè)計和利用寡核苷酸引物,共進行二級PCR反應(yīng)。在初級的兩個PCR反應(yīng)中,每對引物中的一個引物3端與待重組基因互補,5端與另一個待重組基因互補,即在引物的5端加入一段序列作為接頭。分別進行PCR,所得二種PCR產(chǎn)物有部分重疊序列,混合二種初級PCR產(chǎn)物進行次級PCR,經(jīng)過變性和復(fù)性,二種PCR產(chǎn)物通過互補序列發(fā)生粘連,出現(xiàn)二種異雙倍體產(chǎn)物。其中一種產(chǎn)物的3末端單鏈可用Taq DNA聚合酶延伸,產(chǎn)生包含兩個重疊產(chǎn)物全長的片段,作為PCR反應(yīng)的模板。由此進行PCR擴增可產(chǎn)生一個包含兩
16、種基因的重組基因片段,該片段保持了密碼子框架的正確性。 突變體的構(gòu)建 原理同重組體的構(gòu)建相似。在靠近引物5端人為造成引物與模板之間的堿基突變,插入或缺失。兩個初級PCR產(chǎn)物均有PCR引物導(dǎo)入的同樣的突變序列,因此有部分重疊序列,將二個初級PCR產(chǎn)物混合進行次級PCR,即可獲得突變體片段如圖8-7所示。 十六、表達PCR (expression PCR) 表達PCR則是一種更加簡便的體外轉(zhuǎn)錄翻譯的方法。表達PCR是重組PCR的一種,將啟動子序列(5TAA TAC GAC TCA CTA TA 3)和目的基因重組,產(chǎn)生重組DNA,PCR擴增含有啟動子序列的目的DNA片段,可直接進行體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生功能
17、性的蛋白質(zhì)。十七、競爭PCR(competitive PCR) 該法的總策略是采用相同的引物,同時擴增靶DNA和已知濃度的競爭模板,競爭模板與靶DNA大致相同,但其內(nèi)切酶位點或部分序列不同,用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物或用不同的探針進行雜交即可區(qū)分競爭模板與靶DNA的PCR產(chǎn)物,因競爭模板的起始濃度是已知的,通過測定競爭模板與靶DNA二者PCR產(chǎn)物便可對靶DNA進行定量。十八、原位PCR (In-situ PCR) 在單個細胞中進行PCR擴增,然后用特異探針進行原位雜交即可檢出含該特異序列的細胞。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行PCR擴增的方法稱原位PCR。 第三節(jié) PCR技術(shù)
18、在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一、PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是檢測人類白細胞抗原-DQ位點的分型,另外,Y染色體特異DNA (DYZ1、DYZ3) SRY基因的PCR分析使性別鑒定成為常規(guī)。 在Y染色體上只要缺失SRY,個體就發(fā)育成為女性。 用針對SRY基因和X、Y同源序列的兩對引物進行PCR擴增,只有男性出現(xiàn)299bp的擴增片段。用這種方法鑒別胎兒、運動員、犯罪人員等的性別,準(zhǔn)確率極高。二、遺傳病相關(guān)基因的檢測 如圖8-8所示。 如果堿基突變的位置與某種限制性內(nèi)切酶的識別位點相關(guān),突變會產(chǎn)生新的或消除原有的內(nèi)切酶位點,那么用特定的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,通過電泳酶切圖譜就能直
19、接判斷堿基發(fā)生突變與否。若某一遺傳病與這一酶切位點的存在或消失有連鎖關(guān)系,PCR-RFLP即可用于該遺傳病的診斷。 苯丙酮尿癥 地中海貧血 鐮刀狀紅細胞貧血 杜氏營養(yǎng)不良癥 血友病三、致病病毒的檢測 人類免疫缺陷病毒 人類免疫缺陷病毒HIV-1是一種RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒,根據(jù)其保守序列設(shè)計引物,先用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板產(chǎn)生cDNA,再進行PCR擴增。該法比分子雜交、血清學(xué)等診斷方法敏感性高,且操作簡便,是診斷HIV的最佳方法。 PCR可用來追蹤HIV的自然感染史。可在其他血清學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志出現(xiàn)前檢測病毒序列,從而判定無癥狀而且血清陰性患者潛在的HIV的傳播性。 肝炎病毒1.乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) 直接檢測臨床標(biāo)本中HBV DNA序列的存在,對確定患者血液標(biāo)本的感染性。2.丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)與戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV) HCV是單股正鏈RNA病毒,可采用逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合巢式PCR法對急性丙型肝炎作出
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