液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬尿中的22種違禁藥物20121208

1、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬尿中的22種違禁藥物王旭峰 張高奎 楊建文卞愧王宗楠 王立琦 張桂君賀利民*（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理研究室，廣州510642）摘要建立了液相色譜串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜同時測定豬尿液中22種違禁藥物的分析方法。豬尿樣真空冷凍干燥 處理，用10%甲醇水（0.1%甲酸）溶液復(fù)溶，Anpel MCX固相萃取小柱凈化、富集。以0.1%甲酸水溶液和乙 月青為流動相進行梯度洗脫，經(jīng)CNW Athena C-18色譜柱（150 mmX2.1 mm, 5 pm）分離，采用電噴霧電離， 多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式對22種藥物進行定性和定量分析。采用基質(zhì)匹配標準溶液校正，各個藥物的響應(yīng)與 其質(zhì)

2、量濃度在0.5100 pg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）大于0.99；以3倍信噪比（S/N）和10倍S/N 計算方法檢出限和定量限，分別為0.54 pg/L和110 pg/L；在LOQ、10、20及50 pg/L四個添加水平，豬 尿中22種藥物的平均回收率為50.2%97.7%；日內(nèi)相對標準偏差（RSD）和日間RSD分別為1.0%8.6%和 4.7%17.9%。實驗結(jié)果表明，該方法簡單、靈敏、可靠，適用于豬扉-受體激動劑類、激素類、硝基咪唑 類和鎮(zhèn)定類等22種違禁藥物殘留的確證分析。關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；違禁藥物；多殘留檢測；豬尿1引言在畜牧業(yè)生產(chǎn)中獸藥、促生長劑的使用日益頻

3、繁，動物性食品中的獸藥殘留和食品安全 問題成為消費者關(guān)注的焦點1。我國農(nóng)業(yè)部2002年底頒布的235號公告2 中明確規(guī)定禁止用于 食品動物的藥物31種（包括克倫特羅等8 -受體激動劑類、激素類、硝基呋喃類、硝基咪唑 類和鎮(zhèn)定類等），限制使用（允許作治療用，不得在動物食品中檢出）的藥物9種（氯丙嗪、 賽拉嗪、安定、地美硝唑、甲硝唑、苯甲酸雌二醇、苯丙酸諾龍、丙酸睪酮及潮霉素）。目 前，對這些違禁藥物在動物食品中殘留的分析檢測和篩查需要采用數(shù)種分析方法36，既缺 乏時效性也浪費大量人力、物力和財力。開展動物食品中違禁藥物的高通量分析篩查方法研 究具有重要意義。國外采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS

4、/MS）分析檢測動物食品79及環(huán)境水、土壤10,11 中的多類藥物殘留檢測的報道較多；國內(nèi)，有采用LC-MS/MS分析檢測畜禽肉、牛奶基質(zhì)中 3類20種獸藥的檢測和豬肉、豬肝、蝦、牛奶和雞蛋中6類76種獸藥殘留同時測定的報道 12,13，但關(guān)于其它食品基質(zhì)、飼料及尿液中多殘留檢測的報道較少。本研究針對我國動物食 品中違禁藥物殘留監(jiān)測被動的局面，開展采用LC-MS/MS進行高通量禁用藥物篩查，建立了 豬尿中建立了豬尿中8 -受體激動劑（西馬特羅、沙丁胺醇、克倫特羅）、硝基咪唑類藥物（甲 硝唑、地美硝唑、洛硝達唑）、農(nóng)藥（雙甲脒、克百威X鎮(zhèn)定類藥物（賽拉嗪、氯丙嗪、安 眠酮、地西泮）、激素類藥物（

5、群勃龍、諾龍、甲睪酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮、醋酸甲孕酮） 孔雀石綠、隱形孔雀石綠、硝呋烯腙、氨苯砜等22違禁農(nóng)獸藥的多類多殘留分析檢測方法。 方法簡單、靈敏、可靠，各項技術(shù)指標滿足實際樣品中禁用藥物殘留檢測要求。2實驗部分2.1儀器與試劑Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫公司）；API 4000電噴霧-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（應(yīng) 用生物系統(tǒng)公司）；氮氣吹干儀（美國Zymark公司）；固相萃取儀（Waters公司）；真空冷 凍干燥機（德國 Thyracont Elektronic GmbH）。對照品（純度99%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，Sigma公司及Dr. Ehrenstorfer GmbH

6、），甲醇、 乙月青、甲酸及乙酸銨（色譜純，美國Fisher Scientific公司），其它試劑為分析純。豬尿試樣由農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州）提供，處理前于-20C冷凍保存。2.2實驗方法2.2.1豬尿樣品前處理 量取1 mL豬尿試樣置于10 mL離心管中，-20C冷凍1 h，轉(zhuǎn)移至-80C條件下真空冷凍干燥8 h，殘渣加入5 mL 10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液，超聲5 min溶解，離心后凈化。用甲醇活化Anpel MCX SPE小柱，3 mL水和2%甲酸水溶液平衡。將5 mL復(fù)溶液全部過 柱，依次用2%甲酸水溶液和10%甲醇水溶液淋洗，抽干后用3 mL 5%氨化甲醇洗脫

7、。洗脫液于40 C水浴中吹干，加1 mL 10%甲醇水（含0.1%甲酸及10 mmol/L乙酸銨）溶液超聲溶解，過0.22|i m濾膜，上機檢測。2.2.2基質(zhì)匹配標準工作液 各對照品儲備液用甲醇稀釋，配制成10 |ig/mL的中間混和標準 溶液，再用10%甲醇水（含0.1%甲酸及10mmol/L乙酸銨）溶液稀釋成5，10，20，50，100，200，500和1000 pg/L的系列混合標準溶液。取100 L上述系列濃度的標準溶液與按2 2 1方法處理的空白豬尿液900皿渦旋，混勻，制得0.5，1，2，5，10，20，50和100 pg/L的基質(zhì)匹配標準工作液。2.3色譜-質(zhì)譜條件流動相：A為

8、0.1%甲酸水溶液，B為乙青。色譜柱：CNW Athena C18色譜柱（150 mmX2.1 mm i.d., 5 pm）。梯度洗脫條件：08 min， 95%45% A； 811 min，45%5% A； 1115 min， 5% A； 1516 min，5%95% A； 1623 min，95% A。進樣量：10 pL，流速：0.25 mL/min。電噴霧離子源（ESI）：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；電噴霧電壓（IS）： 4 kV; 離子源溫度：650C；碰撞室壓力（CAD）： 27.5 kPa；氣簾氣壓力（CUR）： 137.9 kPa；霧 化氣壓力（GS1）： 379.2

9、kPa；輔助氣壓力（GS2）： 413.7 kPa；滯留時間：150 ms。表1 22種藥物的MRM質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimized MRM mass parameters for 22 analytes化合物Compound保留時間Retention time tR(min)去簇電壓Declusteringpotential(eV)定量離子Quantification transition (碰撞能量 Collision energy, eV)定性離子Qualification transition (碰撞能量 Collision energy, eV)離子豐度比Abundan

10、ce ratio of ions純?nèi)軇㏒olvent豬尿Matrix西馬特羅Cimaterol4.0155220.2202.0 (16)220.2143.2 (14)0.280.31沙丁胺醇 Salbutamol4.3360240.0148.0 (24)240.0221.9 (23)0.200.21克侖特羅Clenbuterol10.3548277.1203.0 (23)277.1259.0 (16)0.220.23甲硝唑 Metronidazole6.8954142.096.2 (25)142.081.1 (35)0.180.21地美硝唑5.7060172.1128.0 (19)172.18

11、2.0 (38)0.370.39Dimetridazole洛硝達唑Ronidazole8.3640201.0140.0 (40)201.0110.2 (18)0.560.52硝呋烯腙Difurazone12.769361.2 221.1 (26)361.2180.1 (30)0.790.84雙甲瞇 Chlordimeform10.5670197.2117.1 (40)197.2152.1 (25)0.440.41克百威 Carbofunan14.6643222.2 165.2 (18)222.2123.1 (31)0.340.36賽拉嗪Xylazine10.7776221.3 90.1 (30

12、)221.3 164.0(35)0.290.31氨苯砜Dapsone11.3280249.2 156.1 (20)249.2 108.1(36)0.650.63安眠酮 Methaqualone15.1590251.2132.1(36)251.291.2(60)0.100.11地西泮Diazepam16.3260285.1154.1 (38)285.1222.2 (38)0.180.19氯丙嗪 Clorpromazine13.3880318.9 86.1 (30)318.9 247.1 (30)0.400.42群勃龍 Trenbolone15.40130271.3 199.2 (35)271.3

13、253.3 (28)0.360.38諾龍 Nandrolone15.6396275.4109.1 (36)275.4257.4 (24)0.810.86丙酸諾龍18.77102331.3 109.2 (33)331.3 275.4 27)0.380.40Nandrolone propionate甲睪酮16.7390303.397.2 (37)303.3109.1 (37)0.170.13Methyl testosterone丙酸睪酮19.03113345.3 109.1 (39)345.3285.4 (25)0.120.11Testosterone propionate醋酸甲孕酮17.7664

14、385.4224.2 (35)385.4267.2 (26)0.880.86Mengestrol acetate孔雀石綠13.98100329.2313.1 (40)329.2208.1 (38)0.320.28Malachite green隱形孔雀石綠14.76100331.4239.1(36)331.4316.1 (20)0.920.91Leucomalachite green3結(jié)果與討論3.1儀器條件優(yōu)化3.1.1質(zhì)譜條件選擇 按照EC第6572002/EC決議的規(guī)定，根據(jù)每種化合物的準分子離子及 其特征子離子的質(zhì)譜圖，選擇兩個子離子與母離子組成兩對離子對進行MRM監(jiān)測。先對每 個藥物(

15、110 g/mL)進行全掃描，確定每種藥物的母離子和子離子，再依次對子離子和碰 撞能進行優(yōu)化，從中選擇兩個相對豐度較高，干擾較少的子離子作為定性離子和定量離子。 與液相色譜連接，進一步優(yōu)化每個藥物的碰撞能量、去簇電壓、滯留時間等質(zhì)譜參數(shù)，建立MRM模式下各種藥物的質(zhì)譜米集參數(shù)（見表1）。3.1.2 色譜柱和流動相的選擇 考察了Thermo Hybrid Golden C18, CNW Athena C18-WP及 Phenomenex Luna C18 （150 mm x 2.1 mm i.d., 5 四m）三種色譜柱和10 mmol/L乙酸銨溶液（含 0.1%甲酸）、0.1%甲酸-乙月青及0

16、.1%甲酸-甲醇三種流動相體系對22種藥物的分離效果。實驗 表明，CNW Athena C18-WP色譜柱在0.1%甲酸-乙青體系，22種檢測藥物分離良好，峰形對 稱尖銳（見圖1, 2）,其它條件下都難以實現(xiàn)22種分析物良好分離和獲得對稱的峰形。Clorpromazin?Xandrolon?ClenbucerolMangestrol acetateMalachite g 是逍i . iJI1III1I1III 24e81D12141 瑟Time, Clorpromazin?Xandrolon?ClenbucerolMangestrol acetateMalachite g 是逍i . iJI1

17、III1I1III 24e81D12141 瑟Time, min182D22圖1 10種藥物標準溶液的總離子流色譜圖（10 pg/L）Fig.1 Ionic chromatograms of 10 compounds in solvent standard at 10 pg/LLeucomalachire greenTestosterone： propionateilon? propionateandrXMhvIJtosteroneu. J1I1I1II1II1I1II1II24081D121410132D22Time, minMethaqualoneDifiirazone圖2 12種藥物標準

18、溶液的總離子流色譜圖（10 pg/L）Fig.2 Ionic chromatograms of 12 compounds in solvent standard at 10 pg/L3.2樣品前處理3.2.1提取 考慮22個目標分析物包括多類、多種違禁藥物，它們的理化性質(zhì)差異大，所 以本研究采用直接將豬尿液真空冷凍干燥，選擇合適溶劑復(fù)溶、離心去除部分不溶雜質(zhì)，再 用固相萃取小柱凈化。該法避免了使用液-液萃取時，因沒有合適的提取溶劑而部分藥物回 收率低的問題。實驗比較了 2%甲酸水和10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液作為復(fù)溶液，結(jié)果 表明，10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液能很好的溶解凍干殘渣中

19、的藥物，作為固相萃取小 柱的上樣溶液，大部分藥物都能夠很好的保留。3.2.2凈化 因目標分析物極性差異較大，而大部分藥物具有弱堿性，所以選擇由非極性 的C18和陽離子交換作用組成的混合型小柱進行富集凈化。實驗比較了 Strata-X-C和Anpel 兩種混合型陽離子交換小柱的效果，二者在回收率和凈化效果方面差異不大，從經(jīng)濟角度考 慮，本實驗選擇Anpel MCX小柱凈化凍干豬尿試樣。復(fù)溶后的豬尿液通過MCX小柱后， 依次用3 mL 2%甲酸水溶液和甲醇淋洗小柱，除去基質(zhì)中的干擾成分。但甲醇淋洗液時發(fā)現(xiàn) 激素類藥物中的群勃龍、諾龍、丙酸諾龍、甲睪酮和丙酸睪酮分別洗脫達96.8%、91.7%、 6

20、2.7%、95.0%和51.6%，用10%甲醇水溶液代替甲醇淋洗，可在除去干擾雜質(zhì)的同時保證 藥物在小柱上的穩(wěn)定保留。用同等體積氨化甲醇或乙青洗脫藥物，乙青未能完全洗脫所有分析物，最終選擇5%的氨化甲醇3 mL作為洗脫液。3.3線性范圍和靈敏度以定量離子峰面積Y為縱坐標，藥物濃度（|幾）為橫坐標進行線性回歸分析。在0.5100 |ig/L濃度范圍內(nèi)，各個藥物基質(zhì)匹配標準曲線線性關(guān)系均良好（r0.99），按3倍信噪比（SW） 計算檢出限（LOD），10倍S加計算定量限（LOQ），西馬特羅、沙丁胺醇、克倫特羅、賽拉 嗪、氯丙嗪、地西泮、氨苯砜、甲睪酮及醋酸甲孕酮的LOD及LOQ分別為0.5和1 p

21、g/L，甲 硝唑、地美硝唑及硝呋烯腙分別為1和2 pg/L，雙甲脒、克百威、安眠酮、諾龍、丙酸諾龍、 丙酸睪酮、孔雀石綠及隱形孔雀石綠分別為2和5 pg/L，洛硝達唑及群勃龍分別為4和10 pg/L。3.4回收率和精密度空白豬尿分別添加LOQ，10，20和50 pg/L的混合標準溶液，并設(shè)空白對照，每個濃度做 5次平行，按照2 2 1方法處理，重復(fù)3天。四個添加濃度水平，22種藥物平均回收率為 50.2%97.7%。日內(nèi)相對標準偏差和日間相對標準偏差分別為1.0%8.6%和4.7%17.9%，結(jié)果 見表3。表2回收率和精密度（n= 5）Table 2 Recoveries and precis

22、ions（n= 5）化合物回收率日內(nèi)相對標準偏差日間相對標CompoundRecoveries (%)Intra-day RSD (%)準偏差添加濃度 (Spiked concentration levels, pg/L)Inter-dayLOQ102050LOQ102050RSD (%)西馬特羅Cimaterol86.092.194.788.73.84.11.94.27.6沙丁胺醇 Salbutamol89.194.896.195.52.93.11.75.68.7克侖特羅Clenbuterol90.397.791.292.34.62.13.86.39.6甲硝唑 Metronidazole68

23、.470.970.069.53.41.81.33.55.6地美硝唑 Dimetridazole85.283.493.589.91.72.71.52.24.7洛硝達唑Ronidazole53.752.954.251.21.71.03.42.49.2硝呋烯腙Difurazone52.654.355.853.86.24.76.85.08.9雙甲瞇 Chlordimeform82.581.287.484.27.96.38.58.315.7克百威 Carbofunan78.380.884.980.06.72.04.43.610.9賽拉嗪Xylazine91.690.292.293.92.71.63.93

24、.85.7氨苯砜Dapsone72.887.476.773.34.93.12.94.610.1安眠酮 Methaqualone83.089.691.988.55.53.97.67.19.6地西泮Diazepam80.185.788.587.72.16.86.24.78.9氯丙嗪 Clorpromazine54.259.656.768.32.53.74.81.07.4群勃龍 Trenbolone81.580.789.487.03.68.07.55.111.3諾龍 Nandrolone87.391.593.690.18.17.51.67.215.9丙酸諾龍Nandrolone propionate

25、66.964.168.368.55.04.74.62.89.6甲睪酮Methyl testosterone85.789.985.292.42.85.73.04.48.2丙酸睪酮Testosterone propionate52.850.256.954.04.26.65.98.617.9醋酸甲孕酮Mengestrol acetate90.487.086.388.73.67.02.56.110.7孔雀石綠Malachite green51.653.457.754.31.92.84.41.77.6隱形孔雀石綠55.854.658.250.43.52.95.48.111.0Leucomalachite

26、 green3.5基質(zhì)效應(yīng)評價液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法在建立和確證過程中需要對基質(zhì)效應(yīng)進行評價，確定樣品 基質(zhì)溶液中的干擾成分對藥物離子響應(yīng)是否存在影響14本實驗通過測定基質(zhì)匹配標準與 純?nèi)軇藴释瑵舛认路治鑫锏碾x子響應(yīng)強度的相對比值來評價基質(zhì)效應(yīng)。圖2為凈化后的空 白豬尿基質(zhì)匹配標準溶液與純?nèi)軇┗旌蜆藴嗜芤褐兴幬锓迕娣e的相對強度比，可見經(jīng)固相萃 取小柱凈化的豬尿基質(zhì)仍然對目標分析物存在不同程度的抑制作用，硝呋烯腙抑制最為嚴 重，基質(zhì)抑制效應(yīng)為40.2%。為補償基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用基質(zhì)匹配標準曲線進行校正。Matrix effect is the average ratio of matri

27、x-matched standards to standards in pure solvent at four spike levels; the error bars represent standard deviations (n = 3).(發(fā))Matrix effect is the average ratio of matrix-matched standards to standards in pure solvent at four spike levels; the error bars represent standard deviations (n = 3).(發(fā))AJa

28、mJU-CJ二 上3.6實際樣品分析為評價方法的適應(yīng)性，用建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定了 200份來自安徽和海南 的豬尿樣品，結(jié)果篩查出2份克侖特羅陽性豬尿，含量分別為4.45和2.16 g/L。該方法操 作簡便，靈敏度高，能準確可靠地用于豬尿中22種違禁藥物的篩查和測定。ReferencesMalik A K, Blasco C, Pico Y. J Chromatogr A, 2010, 1217(25): 40184040The 235th Announcement of ministry of Agriculture- 2002 Maximum Residue Limits of

29、Veterinary Drugs in Animal Derived Food農(nóng)業(yè)部235號公告-2002動物源性食品中獸藥最高殘留限量The 1025th Announcement of Ministry of Agriculture-18-2008， Determination of -Agonists in Animal Derived Food by Tandem-Mass Spectrometry. National Standard of PRC動物源性食品中多種伊激動劑殘留檢測液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法.中華人民共和國國家標準.農(nóng)業(yè)部1025 公告-18-2008HE Li-Min, H

30、UANG Xian-Hui, FANG Bing-Hu, HUANG Shi-Xin, CAO Ying, CHEN Jian-Xin, ZENG Zhen-Ling, CHEN Zhang-Liu. J. Chromatography., 2008, 26(6): 714719賀利民，黃顯會，方炳虎，黃士新，曹瑩，陳建新，曾振靈，陳杖榴.色譜，2008, 26(6): 714719XIE Wen, CHEN Xiao-Mei, HUI Ying, HOU Jian-Bo, XI Jun-Yang, QIAN Yan. J. Instrumental Analysis., 2010, 29(5

31、): 497501謝文，陳笑梅，慧瑛，侯建波，奚君陽，錢艷.分析測試學(xué)報，2010，29(5): 497501GB/T 21311-2007, Determination of the Metabolites of Nitrofuran Antibiotics in Foodstuff of Animal Origin High performance Liquid Chromatography with Tandem-Mass Spectrometric Method. National Standard of PRC動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法一一高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

32、.中華人民共 和國國家標準.GB/T 21311-2007Schneider M J, Lehotay S J, Lightfield A R. Drug Test Anal, 2012, 4 Suppl 1: 91102Gros M, Rodriguez-Mozaz S, Barcelo D. J Chromatogr. A, 2012, 1248: 104121Macarov C A, Tong L, Martinez-Huelamo M, Hermo MP, Chrila E, Wang YX, Barron D, Barbosa J. Food Chem, 2012, 135(4):

33、26122621Salvia M V, Vulliet E, Wiest L, Baudot R, Cren-Olive C. J Chromatogr A, 2012, 1245: 122133Y B Ho, Mohamand Pauzi Zakaria, Puziah Abdul Latif, Nazamid Saari. J Chromatogr A, 2012, 1262: 160168WANG Lian, LI Yuan-Qian, WANG Hai-Bo, GUAN Yan-Li. Chinese J. Anal. Chem., 2011, 39(2): 203207王煉，黎源倩，

34、王海波，官艷麗.分析化學(xué)，2011，39(2): 203207GUO De-Hua, DENG Xiao-Jun, ZHAO Shan-Zhen, ZHU Jian, XIA Chong-Fei, CHEN Shun-Sheng, SONG Yue. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38(3): 318324郭德華，鄧曉軍，趙善珍，朱堅，夏崇非，陳舜勝，宋越.分析化學(xué)，2010，38(3): 318324Rogatsky E, Stein D. J Am Soc Mass Spectrom, 2005, 16(11): 17571759Simultaneous De

35、termination of 22 Prohibited drugs in Swine Urine by Liquid Chromatography Tandem Mass SpectrometryWANG Xu-Feng，ZHANG Gao-Kui，YANG Jian-Wen，BIAN Kui，WANG Zong-Nan，WANG Li-Qi，ZHANGGui-Jun，HE Li-Min*(Department of Pharmacology and Toxicology， College of Veterinary Medicine， South China AgriculturalUni

36、versity， Guangzhou 510642， China)Abstract A liquid chromatography tandem electrospray ionization mass spectrometry method has been developed for the simultaneous determination of 22 prohibited drugs in swine urine. Urine samples underwent vacuum freeze-drying treatment, and then the residue was dissolved with 10% methanol in water containing 0.1% formic acid followed by