從蝦殼中制備蝦青素

1、 PAGE 7從蝦殼中制備蝦青素第一章 原材料的選擇前言蝦青素（Astaxanthin），即 3,3-二羥基 -4,4-二酮基- , -胡蘿卜素，分子4式為 C40H52O，相對(duì)分子質(zhì)量為 596，其構(gòu)造式如下(其中 R= CH)。呈鮮紅色，3在水生動(dòng)物、鳥類羽毛及植物葉、花、果中廣泛存在，具有極強(qiáng)的抗氧化、抗癌變、 增加免疫作用的功能。 蝦青素的生理功能蝦青素可淬滅單線態(tài)氧，去除自由基，阻擋脂質(zhì)過氧化，保護(hù)機(jī)體免受損害, 預(yù)防癌癥發(fā)生，還能促進(jìn)人體免疫球蛋白的產(chǎn)生，具有更高的免疫調(diào)整活性。爭(zhēng)辯說明，蝦青素具有抗氧化活性的類胡蘿卜素,蝦青素的抗氧化性比 -胡蘿卜素高約 10 倍，比維生素 E

2、高約 500 倍。蝦青素已被認(rèn)為是“超級(jí)維生素 E”。體外細(xì)胞培育試驗(yàn)爭(zhēng)辯蝦青素對(duì)鼠免疫活性細(xì)胞的生殖及功能的影響，結(jié)果顯示蝦青素比裸藻酮和 -胡蘿卜素具有更高的免疫調(diào)整活性。最新爭(zhēng)辯說明，蝦青素具有比 -胡蘿卜素更強(qiáng)的抑制癌變的力量。二 蝦青素的商業(yè)開發(fā)由于動(dòng)物本身不能夠合成蝦青素，而且絕大局部動(dòng)物也不能把其他類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成蝦青素，因此必需從食物中攝取蝦青素。目前蝦青素已經(jīng)在美國(guó)被批準(zhǔn)為食品添加劑，并且在三文魚的養(yǎng)殖中得到了很好的應(yīng)用?，F(xiàn)在市場(chǎng)上蝦青素的售價(jià)很高，單價(jià)達(dá) 2000-2500 美元每公斤（蝦青素含量 3%），而蝦青素軟膠囊每瓶 140 元，每瓶蝦青素總量為 360mg。在 2

3、000 年，蝦青素的市場(chǎng)容量估量就已經(jīng)到達(dá)了每年 2 億美元。因此進(jìn)一步爭(zhēng)辯蝦青素對(duì)人體的作用，開發(fā)相關(guān)的保健品和保健化裝品，則可以擴(kuò)大自然蝦青素的應(yīng)用范圍和市場(chǎng)。三 蝦青素的來(lái)源蝦青素主要有兩種生產(chǎn)方式，即化學(xué)合成和自然提取。一）化學(xué)合成蝦青素化學(xué)合成法要經(jīng)過多步化學(xué)和生物催化反響才能完成，其化學(xué)合成的前體物質(zhì)為（S-3-乙酸基-4-氧代- -紫羅酮，它是不同的微生物對(duì)（R）萜烯醇醋酸鹽不對(duì)稱水解，經(jīng)過萃取，反流分布及重結(jié)晶等技術(shù)處理而得到產(chǎn)物。人工合成的蝦青素大多為順式構(gòu)造，而生物體合成的蝦青素大多為反式構(gòu)造。動(dòng)物體對(duì)人工合成的蝦青素吸取力量較弱，而且人工合成的蝦青素的著色力量和生物效價(jià)遠(yuǎn)

4、比自然蝦青素低。因而目前的蝦青素生產(chǎn)主要是從單胞藻、酵母和水產(chǎn)品廢棄物中提取自然蝦青素。二）自然蝦青素的生產(chǎn)利用藻類生產(chǎn)蝦青素目前報(bào)道可生產(chǎn)蝦青素的微藻有雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis ）、湖泊紅球藻（Haematococcus lacustris）和湖泊紅球藻（Chlorococcum sp.）。雨生紅球藻中蝦青素含量可達(dá) 10-40mg/g，是自然界中自然蝦青素含量最高的生物。利用大規(guī)模養(yǎng)殖紅球藻生產(chǎn)蝦青素是目前自然蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的一條重要途徑。但是藻類的自養(yǎng)周期長(zhǎng)，需要光照，生產(chǎn)場(chǎng)所在肯定程度上受到限制，并且藻類破壁釋放蝦青素困難，因此進(jìn)展大規(guī)模生產(chǎn)比較困難

5、。利用發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素已知能生產(chǎn)蝦青素的微生物有乳酸分支桿菌（ Mycobacterium lacticola）、短桿菌 103 （ Brevibacterium ）， 以及真菌擔(dān)子綱的發(fā)夫酵母屬（ Phaffia rhodozyma）。其中乳酸分支桿菌只能在烴類培育基上而不能在養(yǎng)分瓊脂上產(chǎn)生蝦青素，而短桿菌 103 要在石油上生長(zhǎng)，發(fā)酵完畢時(shí)蝦青素產(chǎn)量缺乏 0.03mg/g， 因此，兩者實(shí)際應(yīng)用的意義均不大。酵母作為色素開發(fā)源具有很多有利的條件， 如不需光照，可異養(yǎng)代謝，生長(zhǎng)快、可高密度培育等，用廉價(jià)的纖維素酶水解產(chǎn)物培育的紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量也可到達(dá) 720-1080 g/g，但相對(duì)于

6、紅球藻來(lái)說，酵母中蝦青素的含量仍太低。從水產(chǎn)品廢棄物中提取蝦青素在自然界中，蝦青素主要以酯的形式大量存在于軟體動(dòng)物 (如蝦及蟹)的殼內(nèi)，雖然含量低，甲殼中的灰分和甲殼質(zhì)也限制了蝦青素的提取，但由于目前還沒有找到更好的方法。目前，挪威等國(guó)家承受的青貯技術(shù)的回收率較高 ( 180 g/g 廢棄物) , 且純度也較其他處理方法高。國(guó)內(nèi)外的蝦蟹加工業(yè)每年有 1000 萬(wàn)噸的甲殼類廢棄物，資源豐富。目前，主要是從甲殼類水產(chǎn)品的廢棄物中提取蝦青素。全世界每年有幾百萬(wàn)噸的蝦殼作為甲殼質(zhì)生產(chǎn)的原料，工業(yè)上用酸堿交替法制備甲殼質(zhì)后會(huì)產(chǎn)生大量的含有蝦青素和蛋白質(zhì)的酸堿廢水，對(duì)環(huán)境造成了污染。假設(shè)能在生產(chǎn)甲殼質(zhì)的同

7、時(shí)又能提取出蝦青素和蛋白質(zhì)，不僅可以使企業(yè)獲得更大的經(jīng)濟(jì)利益，而且有利于提高甲殼質(zhì)的質(zhì)量，削減廢水的色度，對(duì)廢水治理具有樂觀的作用。四 水產(chǎn)廢棄物來(lái)源長(zhǎng)江三角洲等地的人寵愛吃龍蝦(本文所指的龍蝦學(xué)名克氏原贅蝦，俗稱淡水小龍蝦)。每只小龍蝦的可食比率為 20%一 30%，還有 70%一 80%的局部(主要為蝦頭和蝦殼)被廢棄。而在這些被廢棄掉的蝦殼和蝦頭里，隱藏著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。假設(shè)能對(duì)廢棄的蝦頭、蝦殼形成產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化的深加工和綜合利用， 其衍生的高附加值產(chǎn)品有近 100 項(xiàng)，轉(zhuǎn)化增值的直接效益將逾 1000 億元。目前，蝦蟹殼大多被當(dāng)作廢物丟棄，既污染環(huán)境，又造成鋪張。若能抓住這個(gè)商機(jī)，變廢

8、為寶，會(huì)得到巨大收獲，前景格外好。目前，龍蝦殼收購(gòu)有很大的市場(chǎng)空間，被收購(gòu)的只占 1/5，很多餐館和家庭都把龍蝦殼當(dāng)垃圾倒掉。南京人每年要消費(fèi)掉 1000 一 2000 噸龍蝦。800 噸螃蟹，扔掉龍蝦蟹殼 1500 噸;合肥人 l 年消費(fèi)龍蝦 4.2 萬(wàn)一 5.4 萬(wàn)噸，扔掉龍蝦殼2 萬(wàn)噸以上。其次章 提取試驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 堿液提取法甲殼加工下腳料中的蝦青素是以結(jié)合蛋白的形式存在的。當(dāng)用酸溶解甲殼上的CaCO3 后，再用堿法(NaOHNa2CO3)煮下腳料時(shí)，其中的蛋白質(zhì)溶出，而與蛋白質(zhì)結(jié)合的蝦青素也隨之溶出，從而到達(dá)提取蝦青素的目的。Mikalsen的專利中最早報(bào)道了這種方法：將蝦殼等置于沸堿

9、液中使蝦青素溶出，然后加酸沉淀或冷卻將蝦青素分別出來(lái)。丁純梅等先將龍蝦殼用1 mol/L HCl 浸泡24 h，后用2mol/LNaOH回流10h，過濾后濾液用酸調(diào)pH 至2，析出沉淀，然后再過濾，沉淀物即為富含蝦青素的提取物。提取步驟：新穎蝦殼洗凈裂開浸泡去液清水洗凈調(diào)pH低溫稀堿浸提過濾 冷卻 調(diào)pH 過濾 磚紅色膏狀物。新穎蝦殼的預(yù)處理: 蝦殼在提取之前需進(jìn)展機(jī)械裂開, 以增大溶劑與殼的接觸面積, 從而提高提取率。常用的裂開方法有組織搗碎、研磨等。mol/LHCl浸泡: 蝦殼上局部色素與碳酸鈣結(jié)合嚴(yán)密, 需對(duì)甲殼進(jìn)展脫鈣處理, 以削減蝦青素與鈣的結(jié)合,從而提高蝦青素的提取率。mol/LN

10、aOH回流:甲殼加工下腳料中的蝦青素大多與蛋白質(zhì)結(jié)合, 以色素結(jié)合蛋白的形式存在。當(dāng)用熱堿液煮下腳料時(shí),其中的蛋白質(zhì)結(jié)合的蝦青素也隨之溶出,從而到達(dá)提取蝦青素的目的。調(diào)pH : 將提取液pH值調(diào)為2, 沉淀蝦青素。最正確的提取條件為固液比1：4(m/V)、氫氧化鈉濃度0.5 mol/L、提取溫度50,該條件下蝦青素的提取率為9. 31%。二 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑是一種提取蝦青素的有效試劑, 通常提取后可將溶劑蒸發(fā), 從而將蝦青素濃縮, 得到濃度較大的蝦青素油, 同時(shí)溶劑也可回收循環(huán)利用。常見的溶劑有丙酮、 乙醇、 乙醚、 石油醚、 氯仿、 正己烷等,不同的溶劑提取效果不同。在爭(zhēng)辯覺察, 丙酮的提

11、取效果最好,而乙醇最差,并且從提取液的吸取波譜看, 不同提取劑提取的色素中其具體成分也有所差異。有機(jī)溶劑法提取可承受浸提和回流提取的方法,但資料報(bào)道較多的主要是浸提法。提取步驟：蝦頭和蝦殼混合物有機(jī)溶劑一次提取抽濾有機(jī)溶劑二次提取抽濾合并濾液稀釋測(cè)定含量常用乙酸乙酯、異丙醇、丙酮、石油醚、乙醇、二氯甲烷為提取溶劑，常溫， 浸提時(shí)間2 h，濃縮后用石油醚溶解，在468 nm 處測(cè)吸光值（蝦青素在石油醚中的最大吸取波長(zhǎng)為468 nm）。提取pH4.0，溫度為50 ，時(shí)間2.5 h，此工藝條件下得到的蝦青素含量最大，為49.1 g/g 原料。提取溫度為主要因素，其次為提取時(shí)間，提取pH 值。三 超臨

12、界 CO2 萃取法蝦殼粉碎稀酸處理沖洗至中性枯燥裝料、密封超臨界靜態(tài)萃取1h超臨界循環(huán)萃取 1h 收集皂化液相色譜分別純化包裝冷凍保藏超臨界 CO2 萃取法提取蝦青素的最正確：萃取壓力為 40MPa，萃取溫度為60,稀酸處理能夠促使蝦青素的提取率高。四 酶處理提取流程蝦殼 5g加緩沖液混合恒溫水浴振蕩酶解冰水浴冷卻布氏漏斗雙層濾紙抽濾并反復(fù)用水沖洗(除去礦物質(zhì)) 沉淀物參加丙酮 25mL置入超聲波清洗池 10min搖床常溫振蕩 1h冷凍離心機(jī)在 10000r/min4下離心10min取上清液理化測(cè)定。最正確工藝條件為：固液比為 1:2，酶解溫度 48.5，酶解 pH 值 5.8，水解時(shí)間 63

13、min，酶與底物比為2522U/g，提取總類胡蘿卜素11576ug/g；高效液相檢測(cè)其蝦青素濃度到達(dá)到達(dá) 13.06，比用有機(jī)溶劑直接提取法的釋放率有顯著提高。五 方法的比較優(yōu)劣及試驗(yàn)方法的選擇堿液提取法在工過程需消耗大量酸堿, 堿提的過程需消耗大量的酸、堿，其廢水對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)峻，而且蝦青素通過在堿性環(huán)境下的高溫處理，蝦青素已被氧化成為鮮紅色的蝦紅素。有機(jī)溶劑法：蝦青素在乙醇等強(qiáng)極性溶劑中的溶解性差，為了提高效率，常需在高溫條件下操作，而蝦青素?zé)岱€(wěn)定性差。超臨界CO2 萃取法：該法可以避開蝦青素的降解，得到高品質(zhì)的產(chǎn)品，又可以有效地提取蝦青素，但原料體積大，含量低，生產(chǎn)本錢高，難適應(yīng)于工業(yè)化生

14、產(chǎn)。本試驗(yàn)選用酶法提取蝦青素。酶法提取蝦青素，此法較其他方法溫存，避開使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿物質(zhì)，生產(chǎn)廢水對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求低，且提取率較高。本方法為蝦的廢棄物的利用供給了新的思路和方法。六 單因素試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)確定蝦殼酶解的五個(gè)因素水解時(shí)間、酶與底物比、溫度、pH 和物液比的最適條件。一）水解時(shí)間確實(shí)定為了確定水解時(shí)間對(duì)水解度的影響，準(zhǔn)確稱取蝦頭30g，在pH9.0、固液比1:1.5、溫度 60、酶與底物比為 2000u/g 的狀況下分別水解 1h、2h、3h、4h、5h、6h，觀看不同酶解時(shí)間對(duì)酶水解效果的影響，繪制趨勢(shì)線。二）酶與底物比確實(shí)定為了確定酶與底物比對(duì)水解效果的影響，準(zhǔn)確稱

15、取蝦頭漿 30g，在 pH9.0、固液比 1:1.5、溫度 60、水解 3h 條件下，分別按酶與底物比 500U/g、1000U/g、1500U/g、2000U/g、2500U/g、3000 U/g、3500u/g 參加酶，觀看不同酶與底物比對(duì)酶水解效果的影響，繪制趨勢(shì)線。三）水解溫度確實(shí)定為了確定水解溫度對(duì)水解效果的影響，準(zhǔn)確稱取蝦頭漿30g，在pH9.0、固液比 l：15、酶與底物比 2000u/g、水解時(shí)間 3h，分別在 30、40、50、60、70下進(jìn)展水解，觀看不同酶解溫度對(duì)酶水解效果的影響，繪制趨勢(shì)線。四）初始 pH 值確實(shí)定為了確定初始pH 對(duì)水解效果的影響，準(zhǔn)確稱取蝦頭漿 30

16、g，在固液比 1:1.5、酶與底物比 2000U/g、水解時(shí)間 3h、水解溫度 60下，分別在pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH 10.0、pH11.O 條件下水解，觀看不同初始pH 值對(duì)酶水解效果的影響，繪制趨勢(shì)線。五）固液比確實(shí)定為了確定固液比對(duì)水解效果的影響，準(zhǔn)確稱取蝦頭漿30g，在pH9.0、酶與底物比 2000U/g、水解時(shí)間 3h、水解溫度 60，分別以固液比 4:1、2:1、1:1、l:1.5、1:3 參加緩沖液，觀看不同的固液比對(duì)酶水解效果的影響，繪制趨勢(shì)線。七 正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝的優(yōu)化依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提取總類胡蘿卜素量為指標(biāo)，選取酶解溫度、酶解 pH、酶解時(shí)間、

17、酶與底物比四個(gè)因素進(jìn)展正交試驗(yàn)。第三章 純化試驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 吸附柱層析分別蝦青素一）吸附柱層析試驗(yàn)裝置圖吸附柱層析試驗(yàn)裝置圖如下圖。二）裝柱稱取肯定質(zhì)量的市售柱層析用硅膠，于110烘箱內(nèi)活化1h。先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走其中的空氣，把預(yù)先用溶劑浸泡好的吸附劑攪勻，隨馬上此懸浮液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4時(shí)翻開柱下端出口，讓溶劑漸漸流出，使柱上端懸浮液緩緩下降，保持吸附劑外表平坦，并始終浸沒在溶劑中，嚴(yán)防氣泡產(chǎn)生。三）上樣用滴管輕輕地把待分別相離樣品溶液加到固定相外表，為避開沖動(dòng)基質(zhì)，在固定相外表加一圓形濾紙。待樣品液的液面流到固定相外表時(shí)，用滴管參加洗脫劑，并同時(shí)翻開裝在柱上端分液漏斗的活塞與層析柱下端活塞。四）洗脫本試驗(yàn)承受梯度洗脫法，通過漸漸轉(zhuǎn)變?nèi)軇┑臉O性使各提取液中各組分依次從柱子上洗脫下來(lái)。五）樣品收集依據(jù)色譜帶的移動(dòng)，每個(gè)譜帶的洗脫液用一個(gè)容器收集，共收得餾份10份，最先收集的洗脫液為餾份1，最終收集的洗脫液為餾份10，每種餾份減壓回收，用少許溶劑溶解，用TLC分析各餾份組分的組成，并用可見分光光度掃描儀掃