血液標(biāo)志物對(duì)阿爾茨海默病診斷價(jià)值的再認(rèn)識(shí)

1、血液標(biāo)志物對(duì)阿爾茨海默病診斷價(jià)值的再認(rèn)識(shí)隨著我國(guó)人口老齡化的加重，老年癡呆的發(fā)病率逐年上升。阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是老年癡呆中最常見(jiàn)的類型，約占60%80%。目前，我國(guó)60歲以上的AD患者約983萬(wàn)，這將為患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為不容忽視的社會(huì)問(wèn)題。時(shí)至今日AD仍無(wú)法治愈，目前應(yīng)用于臨床的藥物僅能延緩疾病進(jìn)展，并不能有效根治疾??；而AD治療藥物的研發(fā)過(guò)程投入高、耗時(shí)長(zhǎng)，且近年來(lái)所進(jìn)行的期藥物臨床試驗(yàn)幾乎均以失敗告終，因此AD的早期診斷、早期干預(yù)變得尤為重要。目前，AD的診斷主要依據(jù)臨床癥狀、認(rèn)知量表評(píng)分、腦影像學(xué)以及分子生物學(xué)標(biāo)志物的改變，其中分子生

2、物學(xué)標(biāo)志物可較早反映神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化，使得AD的診斷大大提前。腦脊液中的生物標(biāo)志物（如A40、A42、tau和p-tau等）可直接反映AD患者的神經(jīng)病理?yè)p傷情況，從而為AD的診斷提供有力依據(jù)。然而，腦脊液標(biāo)本采集是一項(xiàng)侵入性的操作，易引起不良反應(yīng)，限制了其在健康人群篩查中的應(yīng)用。因此，尋找特異性強(qiáng)、靈敏度高、創(chuàng)傷性小、易于采集的生物標(biāo)志物成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。一直以來(lái)，由于血腦屏障的存在，使得反映腦組織神經(jīng)病理?yè)p傷的生物標(biāo)志物在血液中的豐度極低，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)受限于靈敏度難以有效定量檢測(cè)，因此既往的研究認(rèn)為血液指標(biāo)對(duì)于AD的診斷價(jià)值有限。近年來(lái)，隨著超敏檢測(cè)技術(shù)如單分

3、子免疫技術(shù)（single molecule array，SiMoA）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等的應(yīng)用，血液標(biāo)志物在AD中的診斷價(jià)值再次引起了研究者的廣泛關(guān)注。一、AD及其血液標(biāo)志物AD是一種進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，分為臨床前期、輕度認(rèn)知障礙期（mild cognitive impairment，MCI）以及癡呆期。AD的發(fā)生是多系統(tǒng)紊亂的結(jié)果，其病因十分復(fù)雜，存在多種假說(shuō)，包括A蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)、tau蛋白過(guò)度磷酸化假說(shuō)、神經(jīng)炎癥假說(shuō)、膽堿能假說(shuō)以及金屬離子紊亂假說(shuō)等，這些假說(shuō)的提出從

4、各自角度解釋了AD的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也為AD的診斷提供了更多可靠的生物標(biāo)志物。腦組織中A蛋白沉積形成淀粉樣斑塊和tau蛋白過(guò)度磷酸化是AD的主要病理特征，淀粉樣斑塊過(guò)量產(chǎn)生或清除障礙均會(huì)導(dǎo)致A肽鏈聚集成為寡聚體，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞離子通道受阻、鈣穩(wěn)態(tài)改變及線粒體氧化應(yīng)激增加等一系列病理改變。而作為一種微管相關(guān)蛋白，tau蛋白的過(guò)度磷酸化將導(dǎo)致自身微管結(jié)構(gòu)破壞和神經(jīng)退行性病變，進(jìn)而引起神經(jīng)纖維纏結(jié)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元之間信號(hào)處理異常和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。腦脊液中A42、A-40、p-tau等可以直接反映AD的病理改變，目前已被納入AD的診療指南。與腦脊液相比，血液檢測(cè)更具優(yōu)勢(shì)，血清神經(jīng)源性外泌體（neur

5、onally-derived exosome，NDE）中的A、tau蛋白可以自由穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入外周血且不受機(jī)體內(nèi)其他因素的干擾，因此可更加精確地反映AD患者腦組織的神經(jīng)病理改變。近年來(lái)隨著超敏檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，A、p-tau等傳統(tǒng)標(biāo)志物在血液中的價(jià)值被進(jìn)一步發(fā)掘，有可能取代腦脊液檢測(cè)成為AD早期診斷的新方法。神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是繼A沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)之后的AD第三大病理特征。AD患者腦組織中A蛋白聚集導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活，通過(guò)釋放促炎因子來(lái)吞噬A蛋白，若A蛋白持續(xù)增加，超過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞的清除能力，則會(huì)促發(fā)炎癥細(xì)胞因子的大量釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和神經(jīng)毒性，引起認(rèn)知功能損傷。除小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫參

6、與AD神經(jīng)炎癥過(guò)程外，適應(yīng)性免疫如T、B淋巴細(xì)胞等在AD的發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用，通過(guò)檢測(cè)血漿中的炎癥因子、補(bǔ)體及淋巴細(xì)胞等免疫相關(guān)因子可進(jìn)一步反映AD的病理改變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行損傷是AD的又一重要病理特征。神經(jīng)絲蛋白輕鏈（neuroflament protein light chain，NfL）是構(gòu)成神經(jīng)元軸突中間纖維的特異性蛋白，是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要成分，其異常表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在AD患者早期的病理改變中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性改變，一方面引起NfL升高，另一方面引起反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，進(jìn)而導(dǎo)致膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidi

7、c protein，GFAP）的過(guò)度表達(dá)，因此檢測(cè)血漿中NfL和GFAP的水平可反映AD早期的神經(jīng)病理?yè)p傷情況。二、血液標(biāo)志物在AD中的診斷價(jià)值（一）血漿A42/A40A蛋白主要包括A40和A42，目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在AD的診斷中，相較于單獨(dú)檢測(cè)A40或A42，血漿A42/A40有著更高的診斷價(jià)值。Ovod等運(yùn)用LC-MS/MS檢測(cè)A42和A40在認(rèn)知未受損者和AD患者血漿中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在AD患者血漿中A42/A40的比值降低，且該比值低的認(rèn)知未受損者未來(lái)發(fā)生淀粉樣變性的概率約為89%。Prez-Grijalba等研究發(fā)現(xiàn)與認(rèn)知未受損者相比，MCI患者血漿中A42/A40比值降低，該組患者

8、2年內(nèi)進(jìn)展為癡呆期的風(fēng)險(xiǎn)增加約70%。除了在癡呆期患者血漿中差異表達(dá)外，A42/A40在AD臨床前期的診斷中也具有一定價(jià)值，如Verberk等運(yùn)用單分子免疫技術(shù)檢測(cè)血漿中A42和A40，發(fā)現(xiàn)在A+的受試者血漿中A42/A40顯著低于A-受試者，且A42/A40對(duì)于這2組的鑒別有著較高的敏感度（90%）和特異度（80%）。中國(guó)阿爾茨海默病癡呆診療指南（2020年版）指出：血漿A42/A40比值降低定義AD癡呆和MCI的性能高，其區(qū)分AD和MCI與健康對(duì)照的合并敏感度和特異度分別為0.85和0.97，AUC為0.92。（二）血漿p-tau蛋白根據(jù)磷酸位點(diǎn)的不同，p-tau主要有p-tau181、p

9、-tau231、p-tau217等，其中p-tau181可以較精確反映腦組織內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的負(fù)荷情況，并且與海馬體萎縮等AD的早期病理改變有著密切聯(lián)系，因此對(duì)于早期AD具有較好的提示作用。近年來(lái)，隨著超敏檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，血漿p-tau181在AD診斷中的價(jià)值被進(jìn)一步肯定，其在MCI及AD癡呆患者血漿中的表達(dá)水平顯著高于認(rèn)知未受損者，且血漿p-tau181高表達(dá)的認(rèn)知未受損者（或MCI患者）進(jìn)展為癡呆期的幾率更高，因此可用于AD疾病進(jìn)展的監(jiān)測(cè)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)血漿p-tau181和p-tau231在認(rèn)知未受損的A+受試者中的表達(dá)水平顯著高于認(rèn)知未受損的A-受試者，進(jìn)一步表明了兩者在AD臨床前期

10、診斷中的價(jià)值。除了臨床前期，血漿p-tau231在AD臨床期診斷中也有著較高的價(jià)值，有研究認(rèn)為相對(duì)于A-認(rèn)知未受損者，p-tau231在AD患者血漿中顯著上調(diào)，診斷AUC為0.920.94，而在鑒別癡呆期與A-的MCI時(shí)，AUC為0.89。相較于p-tau181和p-tau231，血漿p-tau217可以更早提示AD的發(fā)生，Palmqvist等的研究發(fā)現(xiàn)PSEN1 E280A突變攜帶者血漿p-tau217水平隨年齡增長(zhǎng)而升高，在24.9歲時(shí)與非攜帶者出現(xiàn)明顯差異，這比突變攜帶者出現(xiàn)輕度認(rèn)知障礙的時(shí)間提前了約20年，可見(jiàn)p-tau217在AD患者的臨床前期就已經(jīng)升高，且這種變化發(fā)生于PET（正電

11、子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像）檢測(cè)出tau陽(yáng)性之前。在鑒別AD與非AD方面，血漿p-tau181、p-tau231及p-tau217同樣表現(xiàn)突出，診斷AUC分別為0.94、0.93和0.96。（三）血液神經(jīng)退行性相關(guān)蛋白NfL可直接反映神經(jīng)元退行性損傷情況，其在腦脊液和血液中相關(guān)性很好（r值為0.700.97），是第一個(gè)被證實(shí)具有臨床價(jià)值的神經(jīng)特異性生物標(biāo)志物。NfL對(duì)家族性AD具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，Preische等的研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于未突變者，攜帶AD相關(guān)基因（APP、PSEN1、PSEN2）突變的AD高風(fēng)險(xiǎn)人群在認(rèn)知障礙發(fā)生前6.8年其血清NfL水平就已經(jīng)顯著升高，其中PSEN1 E280A突變攜

12、帶者血清NfL的升高要更早（22年前）。另有研究認(rèn)為血漿NfL在A+認(rèn)知未受損者中的表達(dá)水平顯著高于A-認(rèn)知未受損者，表明血漿NfL對(duì)于散發(fā)性AD也有一定的提示作用。另外，MCI患者血漿NfL水平與其認(rèn)知能力呈負(fù)相關(guān)，且高表達(dá)NfL的MCI患者更易進(jìn)展為癡呆期。1項(xiàng)歷時(shí)11年的多中心隊(duì)列研究表明：相對(duì)于認(rèn)知未受損者，血清NfL在MCI和癡呆期患者中均上調(diào)表達(dá)，它在認(rèn)知未受損者中的平均值為32.1 ng/L，MCI為37.9 ng/L，癡呆期為45.9 ng/L，其對(duì)癡呆期的診斷價(jià)值最高，AUC為0.87。GFAP是另一種反映AD早期神經(jīng)病理?yè)p傷的標(biāo)志物，Stocker等對(duì)768名受試者進(jìn)行了長(zhǎng)

13、達(dá)17年的跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)進(jìn)展為AD的受試者在確診前917年，血漿GFAP水平就已經(jīng)顯著升高，這種變化要早于p-tau181和Nfl，而與穩(wěn)定型MCI患者相比，之后進(jìn)展為癡呆期的MCI患者的血漿GFAP出現(xiàn)明顯的縱向增長(zhǎng)。此外，血漿GFAP水平與AD患者的認(rèn)知水平呈反比，血漿GFAP高水平表達(dá)的AD患者，其記憶評(píng)分顯著低于GFAP低表達(dá)的AD患者。由于血漿中NfL和GFAP的含量偏低，酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法難以測(cè)出，因此目前的研究大多選擇靈敏度更高的SiMoA方法。（四）免疫相關(guān)因子人體免疫系統(tǒng)失調(diào)所導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是AD的早期事件，炎癥因子釋放、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)以及補(bǔ)體系統(tǒng)的異常激活在AD的發(fā)生

14、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。1.神經(jīng)炎癥因子：在AD發(fā)病早期，A和APP（淀粉樣前體蛋白）通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元釋放炎癥因子，而炎癥因子的釋放進(jìn)一步促進(jìn)了A沉積，形成惡性循環(huán)。目前研究較多的炎癥因子有C反應(yīng)蛋白（C-reactionprotein，CRP）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）、IL-12等。其中，CRP作為炎癥反應(yīng)的明星分子，其在AD中的診斷價(jià)值受到研究者的廣泛關(guān)注。一直以來(lái)，對(duì)于CRP在AD患者血漿中的表達(dá)情況并無(wú)一致結(jié)論，然而最近Krance等的薈萃分析認(rèn)為，與健

15、康受試者相比，CRP在AD患者外周血中上調(diào)表達(dá)，有望成為AD的診斷標(biāo)志物。近年來(lái)IL-1、IL-6和TNF-在AD中的表達(dá)情況仍存在不確定性，矛盾結(jié)論的出現(xiàn)或許與AD神經(jīng)炎癥內(nèi)環(huán)境的紊亂有關(guān)。另外，炎癥相關(guān)因子血清可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2（soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 2，sTREM2）也參與了AD的神經(jīng)炎癥過(guò)程，它在AD患者大腦中上調(diào)表達(dá)并通過(guò)激活炎癥反應(yīng)而致病。研究表明：AD患者外周血單核細(xì)胞中的sTREM2無(wú)論在mRNA水平還是蛋白水平都顯著高于對(duì)照組，且與AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。Zhang等最近的研究發(fā)現(xiàn)，s

16、TREM2在AD患者和認(rèn)知未受損者血清中差異表達(dá)，其對(duì)AD的診斷敏感度較高為81.8%，AUC為0.677 3。2.免疫細(xì)胞在AD中的診斷價(jià)值：神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)是AD的特征之一，在AD的發(fā)病過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元或內(nèi)皮細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子和趨化因子可將外周單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等吸引到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而靶向調(diào)節(jié)A蛋白的形成。既往的研究認(rèn)為，AD患者外周血中淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量減少，而中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞則無(wú)明顯變化。近年來(lái)，隨著檢測(cè)方法的提高以及研究的進(jìn)一步深入，越來(lái)越多的研究者將目光投向了T淋巴細(xì)胞亞群在AD診斷中的價(jià)值，他們發(fā)現(xiàn)AD患者外周血中的CD4+T

17、淋巴細(xì)胞水平升高，且升高程度與AD患者的認(rèn)知缺陷密切相關(guān)。然而，AD患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞的作用存在一定爭(zhēng)議，既往的研究認(rèn)為CD8+T淋巴細(xì)胞在AD外周血中升高，而最近Xu和Jia的研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞在AD外周血中水平降低，這進(jìn)一步揭示了AD發(fā)生過(guò)程中T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫微環(huán)境惡化。除T淋巴細(xì)胞外，其他免疫細(xì)胞在AD的發(fā)病中也發(fā)揮了一定的作用，如Wang等最近的研究發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于健康對(duì)照，AD患者外周血中靜息自然殺傷細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞以及活化肥大細(xì)胞的水平升高。由此可見(jiàn)，外周血免疫細(xì)胞的功能障礙可能是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫環(huán)境惡化的因素之一，檢測(cè)外周血免疫細(xì)胞

18、及其亞群對(duì)AD的診斷具有一定的指導(dǎo)意義。3.補(bǔ)體在AD中的診斷價(jià)值：補(bǔ)體系統(tǒng)是人體先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，多種補(bǔ)體分子在AD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前研究較多的補(bǔ)體有：補(bǔ)體因子H、凝聚素、血漿因子、C4d和iC3b等，其中凝聚素在AD中的作用備受研究者關(guān)注，既往的研究認(rèn)為凝聚素是AD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，其在AD和MCI患者血漿中表達(dá)上調(diào)，且在進(jìn)展型MCI患者血漿中的表達(dá)水平顯著高于穩(wěn)定型MCI。另有研究認(rèn)為凝聚素在AD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)的作用，它作為伴侶蛋白可改變A蛋白的聚集性和毒性，以達(dá)到清除A蛋白的目的。然而隨著研究的逐漸深入，凝聚素對(duì)于AD的診斷面臨挑戰(zhàn)，如最近一篇綜合了

19、20項(xiàng)研究的薈萃分析認(rèn)為：與健康對(duì)照相比，凝聚素在AD患者血漿中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除凝聚素外，其他補(bǔ)體分子（如C3、C4、C1-抑制子）也參與了AD的炎癥反應(yīng)過(guò)程，而最新的研究發(fā)現(xiàn)C1q、C4a、C9在AD患者血漿中呈上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步揭示了補(bǔ)體分子在AD診斷中的意義。（五）血液神經(jīng)源性外泌體蛋白超敏檢測(cè)技術(shù)的運(yùn)用顯著降低了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)A檢測(cè)的影響，提高了A蛋白檢測(cè)的靈敏度，然而由于血液中非腦組織來(lái)源的A蛋白（如血小板中的A蛋白）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，檢測(cè)特異性還有待進(jìn)一步提高。NDE可自由穿越血腦屏障而不受外界干擾，因此可以更加準(zhǔn)確反映AD大腦組織的神經(jīng)病理改變，Jia等發(fā)現(xiàn)A、tau蛋白在外周血N

20、DE和CSF中的表達(dá)高度相關(guān)，且AD患者外周血NDE中的A42、t-tau和p-tau181的表達(dá)水平顯著高于遺忘性輕度認(rèn)知障礙患者及健康對(duì)照，其診斷效能可與CSF相一致。突觸功能障礙及丟失是AD發(fā)生的早期事件，與AD患者的認(rèn)知功能下降有著密切聯(lián)系，突觸相關(guān)蛋白Neurogranin、SNAP-25、synaptotagmin1、GAP43在AD患者血漿神經(jīng)源性外泌體和腦脊液中的表達(dá)具有相關(guān)性，它們?cè)贏D患者血漿NDE中下調(diào)表達(dá)，四者聯(lián)合檢測(cè)可將AD的診斷提前57年。（六）血液中微小RNA（microRNA，miRNA）MiRNA與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化和突觸可塑性相關(guān)，并參與包括AD在內(nèi)的多種

21、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，約70%的miRNA位于大腦內(nèi)，它們通過(guò)血腦屏障進(jìn)入外周血，進(jìn)而間接反映不同的神經(jīng)病理變化過(guò)程。MiRNA可通過(guò)靶向調(diào)控APP、A和tau相關(guān)基因，進(jìn)而影響AD的發(fā)生發(fā)展，如miR-29c通過(guò)靶向調(diào)控BACE1調(diào)控A蛋白沉積，miR-200a-3p通過(guò)調(diào)控BACE1和PRKACB以保護(hù)神經(jīng)元免受A蛋白毒性和tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響。Tan等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和miR-let-7d-5p在AD患者和健康對(duì)照人群血清中表達(dá)有差異，其中miR-342-3p在鑒別AD時(shí)有較高的特異度（70.1%）和敏感度（81.5%）。然而單一miRNA對(duì)于AD的診斷效能往往低于多種miRNA的聯(lián)合檢測(cè)，Leidinger等檢測(cè)了12個(gè)神經(jīng)相關(guān)的血漿miRNA，