基因工程工具酶 (3)講稿

1、關(guān)于基因工程工具酶 (3)第一張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DN聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對(duì)野生菌株（或真核生物如酵母）進(jìn)行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。 基因工程工具酶第二張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA 進(jìn)而降解非己 DNA 的防御工具。在研究掌握了利用這些

2、酶類對(duì)基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具?；蚬こ坦ぞ呙傅谌龔?，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因工程工具酶及其應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶主要用于DNA分子的特異切割DNA連接酶用于DNA和RNA的連接DNA聚合酶用于DNA和RNA的合成核酸末端修飾酶用于DNA和RNA的末端修飾核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 其它酶類-用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測(cè)等。第四張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內(nèi)切酶(restriction enzyme)限制性核酸內(nèi)切酶(restriction enzyme)限制性內(nèi)切

3、酶的發(fā)現(xiàn) 限制性內(nèi)切酶的分類 限制性內(nèi)切酶的命名 限制性內(nèi)切酶的活性單位 限制性內(nèi)切酶的切割特點(diǎn) 限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 第五張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一 . 限制性內(nèi)切酶的概念核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來；核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3，5磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。 第六張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 細(xì)菌的限制修飾作用1952 年，Luria 和 Human， 1953年，Bertani 和 Weigle 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制

4、（restriction）現(xiàn)象：Phage（k） E.coli kE .coli B【E .coli B 限制 （k）】感染不感染第七張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體侵染細(xì)菌第八張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體侵染細(xì)菌 仍有少量phage (K) 可在 E. coli B 中生存，是因?yàn)镋.coli B phage 對(duì) (K) 進(jìn)行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phage (B)修飾的phage (K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修飾作用）第九張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月R-M 系統(tǒng) 細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，

5、構(gòu)成了寄主控制的限制修飾系統(tǒng) (R-M Restriction-modification system)。 R-M 系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌 R-M 系統(tǒng)的限制酶可以降解 DNA，為避免自身 DNA 的降解，細(xì)菌可以修飾（甲基化酶）自身 DNA，未被修飾的外來 DNA 則會(huì)被降解。 個(gè)別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。第十張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968 Linn 和 Arber 從 E.coli B 中發(fā)現(xiàn)限制酶 1970 Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶 1978 W. Arber，H. O.S

6、mith，Nathans 因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)金 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并對(duì) DNA 分子進(jìn)行切割的一種酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。第十一張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EcoR IEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào) 若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。 限制性核酸內(nèi)切酶的命名第十二張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位 50L Buffer 中，含1g 底物 DNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保

7、溫 1 小時(shí)，能使 1g DNA 完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用 U 表示。 buffer （pH=8.0） ： 50 mmol/L Tris-HCl 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L DTT或巰基乙醇 100g BSA/ml （DDT：二硫蘇糖醇 BSA：牛血清蛋白) 第十三張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)在 DNA 分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割 DNA 分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。 2 個(gè)單鏈斷裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)。斷裂結(jié)果形成的 DNA 片段，具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。第十四張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)

8、作于2022年6月識(shí)別序列 絕大多數(shù)的型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由4-8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些識(shí)別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列。 識(shí)別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的 (如 GANTC)兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。A B C C B A A B C C B AA B N B AA B N B A A B B A A B B A 或或第十五張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月EcoR 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 不同核酸內(nèi)切酶的特異識(shí)別位點(diǎn)Pst5 C T G C A G3 3

9、 G A C G T C .5 第十六張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割位點(diǎn)核酸內(nèi)切酶Hind對(duì)雙鏈DNA分子的切割作用第十七張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、種酶切末端 平齊末端（如 Sma、Alu、Hae） 5-GG CC-3 3-CC GG-5 5-GG- -CC-3 3-CC- -GG-5 5粘性末端（如 EcoR ） 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G- -AATTC-3 3-CTTAA- -G-5 3粘性末端（如 P

10、st ）第十八張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月同裂酶和同尾酶 同裂酶：來源不同的限制酶識(shí)別相同的核苷酸靶序列。產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。 如：Hpa和 Msp均可切割 C CGG。 當(dāng)胞嘧啶甲基化后， Msp不能再切割。 同尾酶：來源不同，識(shí)別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后 DNA 分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。第十九張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 Bcl5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 BglBamH Bcl Bgl三種酶可產(chǎn)生相同的 5GATC

11、粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的 DNA 片段可因粘性末端的互補(bǔ)而彼此再連接起來。第二十張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 1. 底物 DNA （1）DNA 純度: RNA 與 E 結(jié)合影響有效酶濃度； （2）DNA 濃度: DNA 過大，抑制酶活，影響酶分子擴(kuò)散 如：4g DNA /1U HPa 50l 37 15h 1g DNA /1U HPa 50l 37 1h 第二十一張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）識(shí)別位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)特異性序列 如：pBR322 DNA 有 4個(gè) Nar切點(diǎn) (GGCGCC)其中 2 個(gè)切點(diǎn)用1U 酶水解 1h 完全切開,

12、 2 個(gè)切點(diǎn)用50U 酶水解 16h 水解不完全。 Xma 切點(diǎn)（CGGCCG）在GGCGGCCGCC時(shí)不切割。 （4）DNA 二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu) 如：超螺旋 DNA (病毒或質(zhì)粒) 比線狀 DNA 需酶多 （5）提取時(shí)混入雜質(zhì)可改變識(shí)別特異性 如： 高濃度 Hg2+、酚、 氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl 等。第二十二張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2.反應(yīng)系統(tǒng)因素 （1）緩沖液（無(wú)菌、無(wú)污染） （2）金屬離子 如：型酶需 Mg2+，若以 Mn2+ 代替Mg2+（如Hind，EcoRI）則特異性改變。 離子濃度不合適會(huì)抑制酶活。 （3）牛血清蛋白 (BSA) BSA 是酶穩(wěn)定

13、劑，可避免熱、表面張力、化學(xué)品導(dǎo)致的酶變性。過量 BSA 會(huì)引起電泳拖尾。限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件第二十三張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 星活性 限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬。 EcoR在正常情況下識(shí)別 GAATTC 序列發(fā)生切割，但如果緩沖液中甘油濃度超過 5%，其識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生松動(dòng)，可在 AATT 處發(fā)生切割，EcoR這種特殊的識(shí)別能力叫做星活性，用 EcoR*表示。星活性可造成位點(diǎn)切割機(jī)率不等，降解不完全。 影響因素：甘油濃度 12-20%，酶與 DNA 比例，離子強(qiáng)度，45% 聚乙二醇 (PEG)，有機(jī)溶劑，8% 二甲基亞楓，二價(jià)陽(yáng)離子，12% 乙醇。 限制性核酸內(nèi)切酶的

14、反應(yīng)條件第二十四張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA前的切割 構(gòu)建新質(zhì)粒 構(gòu)建物理圖譜 DNA分子雜交 用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA 制備DNA探針 亞克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用第二十五張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月重組DNA前的切割 構(gòu)建新質(zhì)粒 構(gòu)建物理圖譜 DNA分子雜交 用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA 制備DNA探針 亞克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用第二十六張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 甲基化酶分兩類： 維持性甲基化酶：用于在新合成的 DNA 鏈上進(jìn)行甲基化的酶。甲

15、基化位置與模板鏈上的相同。 構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的 DNA 鏈上進(jìn)行甲基化的酶。 用甲基化酶進(jìn)行甲基化的作用 封閉 DNA 鏈中的某些識(shí)別位點(diǎn)，保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。 構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)第二十七張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA連接酶（ligase） 能夠催化 DNA 中相鄰的 3-羥基和 5-磷酸基末端之間形成3，5-磷酸二酯鍵; T4DNA 連接酶 可連接帶匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的雙鏈 DNA 分子相互連接。 大腸桿菌 DNA 連接酶 只能連接帶匹配粘末端的 DNA 分子.第二十八張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口

16、, 缺口, 斷口缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut)3HO P53HO P5第二十九張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月AATTC GG CTTAAAATTC GG CTTAA5 555(1) (2)AATTC GG CTTAAAATTC G G CTTAA55AATTC GG CTTAA5 5(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接(1) (2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶第三十張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一. DNA的連接方法 兩種不同的DNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進(jìn)行連接,而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的DNA結(jié)構(gòu). 1. 直接連結(jié)法-該法適用

17、于: 1)同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相同粘性末端 重組DNA可用同種酶再切開 2) 不同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相容性末端 i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重組DNA分子可為其中一種酶所作用,但為另一種酶作用的可能性較小,如MboI/BamHI 3) PCR產(chǎn)物與特定載體的連接 4) 限制酶和其他方式產(chǎn)生的平末端.第三十一張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.人工接頭連接法1) 人工接頭（linker）的結(jié)構(gòu) i. 中軸對(duì)稱互補(bǔ),可自行退火形成雙鏈.如: 5-CCGGAATTCCGG- 3 3-GGCCTTAAGGCC-5 i

18、i. 至少有一特定的限制酶識(shí)別位點(diǎn) iii. 某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達(dá)載體保持同相.如: 八聚體 d(GGAATTCC) 十聚體 d(CGGAATTCCG) 十二聚體 d(CCGGAATTCCGG)2) 用途 i. 平整末端的連接(各種結(jié)構(gòu)的DNA末端均可經(jīng)過修飾變成平整末端) 2 X 5-CCGGAATTCCGG-3退火第三十二張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 ii. 產(chǎn)生新的克隆位點(diǎn) iii. 合成匹配接頭3) 連接方法 人工接頭磷酸化 退火形成雙鏈 與目的DNA相連 限制 酶切 兩DNA分子相連4) 適用范圍 人工接頭連接法適合于那些只有一種DNA片段需加人工

19、接頭就可以與另一DNA分子相連的DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個(gè)平端的DNA分子相連.這種直接相連的辦法簡(jiǎn)便,快速,但最后連接起來的DNA可能具有不同的結(jié)構(gòu).為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,可先使一種DNA先加上人工接頭后,再與另一種DNA分子相連.第三十三張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 匹配接頭連接法人工接頭雖然可連接兩個(gè)具不同末端的DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時(shí)實(shí)驗(yàn)不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時(shí),便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不同末端的DNA分子:i. 平端 + 突起末端(5-突起, 3-突起)ii.粘性末端 (5-突

20、起 + 5-突起: EcoRI+HindIII 5-突起 + 3-突起: EcoRI+PstI 3-突起 + 3-突起: PstI+SacI)1)匹配接頭的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) i. 由兩個(gè)低聚核苷酸組成 ii. 部分區(qū)域可以互補(bǔ) iii. 退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個(gè)不同的末端2)匹配接頭的種類第三十四張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 i. 預(yù)制匹配接頭(連接平端和粘性末端) 人工接頭 + 匹配接頭 預(yù)制匹配接頭 ii. 轉(zhuǎn)換匹配接頭(連接5-突起和3-突起末端) 二匹配接頭退火 轉(zhuǎn)換匹配接頭 二人工接頭 連接酶 雙酶切 轉(zhuǎn)換匹配接頭 iii. 單鏈匹配接頭(連接5-突起和3-突起末端)

21、4. 同聚物加尾連接法 在兩個(gè)不同的DNA分子末端各加上一個(gè)可互補(bǔ)的同聚物,即AT或GC.5. 連接方法的選擇 方法選擇的依據(jù): 1) 兩DNA分子的末端結(jié)構(gòu) 2) DNA 分子的限制酶譜 3) 是否需要回收DNA片段第三十五張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月連接方式的選擇載體末端 外源DNA末端 常規(guī)連接 脫磷酸化 同聚物 平端連接 補(bǔ)齊,人工接頭 結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu) 載體 加尾 外切酶 5-突起 相容5-突起 第二選擇 第一選擇 不能 不能 不能 5-突起 非相容5-突起 不能 結(jié)合使用接頭 不能 不能 第一選擇 3-突起 相容3-突起 唯一選擇 不能 不能 不能 不能 3-突起 非相容3

22、-突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇 或平端 3-突起 5-端突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇 (補(bǔ)齊后) 平端 平端 不能 可能 可能 第一選擇 可能 平端 3-或5-突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇第三十六張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二. DNA的連接反應(yīng) 1. 連接反應(yīng)理論 當(dāng)兩種DNA分子相連時(shí),它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果,這些結(jié)果與以下因素有關(guān): 1)連接反應(yīng)系統(tǒng)中的總DNA濃度i 2)一個(gè)DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度j, 該值與DNA的長(zhǎng)度成反比,即DNA分子越大,該分子的兩末端越不易相互作用(即自身環(huán)化) 3)兩種不同DNA分子的克

23、分子濃度之比值. 2. 連接反應(yīng)條件 1)評(píng)估連接反應(yīng)結(jié)果的方法 i. 瓊脂糖凝膠電泳 ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化 2)反應(yīng)條件第三十七張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 i. 溫度 ii. ATP濃度 iii. 時(shí)間 iv. 連接酶濃度 v.克分子比率第三十八張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA 聚合酶（DNA polymerase）DNA 聚合酶 指在 DNA (或 RNA) 模板指導(dǎo)下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物 3 OH 末端聚合DNA 鏈的一類酶。 DNA 聚合酶在 DNA復(fù)制時(shí)起關(guān)鍵作用。 DNA 聚合酶主要有三類：聚合酶（pol），聚合酶(pol)

24、 ，聚合酶(pol)。其中聚合酶參與 DNA 修復(fù)，聚合酶參與 DNA 復(fù)制。聚合酶是基因工程中的常用酶。 第三十九張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA 聚合酶和 的比較第四十張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA 聚合酶的特點(diǎn)： 需模板 (DNA 或 RNA)； 需引物； 具有三種酶活性，即 53聚合酶活性；53外切酶活性和 35外切外切酶活性。DNA 聚合酶（DNApolymerase）第四十一張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA聚合酶在 DNA 復(fù)制過程中的作用第四十二張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、 53聚合酶活性： CCG GGCTAT

25、CGGE.coli DNApolIMg 2+，4dNTPCCGATAGCC GGCTATCGG2、53外切酶活性 3、35外切酶活性 GATAGCC AGCTATCGGTCGATAGCC AGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+ pC，pT5TCGATAGCC AGCTATE.coli DNApolIMg 2+TCGATA AGCTAT+ pC，pG，pC5DNA 聚合酶的三種活性第四十三張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA 的切口平移（nick translation） DNA 聚合酶在分子克隆中的主要用途是通過 DNA 缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)

26、記的 DNA 探針。此時(shí)， DNA 聚合酶的 5- 3核酸外切酶活性和 5-3 聚合酶活性同時(shí)發(fā)生。5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 5-3外切酶活性5-3聚合酶活性5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 未經(jīng)標(biāo)記的核苷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸第四十四張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA 雜交探針的制備5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 *(a)(b)(c)(d)(e)(a) 雙鏈的DNA分子(b) 帶有3-OH末端的單鏈缺口(c) pol從5-P移去一個(gè)核苷酸(d) pol將32P標(biāo)記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)

27、重復(fù)(c)(d)的步驟，缺口沿5-3方向移動(dòng)，形成32P標(biāo)記的核苷酸合成的DNA鏈第四十五張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月探針（probe） 探針：用來探知被測(cè)物存在的小 DNA 或RNA叫做探針。 標(biāo)記物：探針上結(jié)合有易被檢測(cè)的化合物稱為標(biāo)記物。 分子雜交：探針 DNA 或 RNA 與被測(cè)物的互補(bǔ)結(jié)合叫做分子雜交（molecular hybridization）第四十六張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA聚合酶 來源 E.coli，由染色體 DNA 基因編碼。商品上用的此酶來源于 Phage NM964 整合的溶源性 E.coli。 結(jié)構(gòu) 一條多肽鏈，MW = 109，

28、000 D。 活性 5 3聚合，3 5和 53外切。第四十七張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Klenow來源： E.coli DNA Polymerase經(jīng)蛋白酶水解的大片段 (Klenow 和 Henningseon.1970DNApol枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C 端 (76kd) + N 端（36kd） Klenow 5 3聚合 3 5外切 5 3外切 第四十八張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Klenow 用途 填補(bǔ)限制酶的 5-粘性末端為平齊末端 5CC 3GGAATT5CCTTAA3 3GGAATT5 Klenow3-末端標(biāo)記 Klenow 在無(wú)底物時(shí)只進(jìn)行 3 5

29、外切；有底物存在時(shí)則聚合。 這種標(biāo)記也稱作交換標(biāo)記，但 Klenow 作用不如T4DNA聚合酶。第四十九張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月T4DNA 聚合酶 來源：T4Phage 感染的 E.coli 結(jié)構(gòu)：MW=114,000 d 活性： 53聚合活性； 35外切活性，對(duì)單鏈活性大于雙鏈DNA，外切酶活性比 Klenow 大 200 倍 用途 填補(bǔ)或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的 5- 粘性末端的3-凹缺末端。（同 Klenow） 3- 粘性末端的標(biāo)記制備 DNA探針,同 Klenow 末端標(biāo)記。 第五十張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月T7DNA聚合酶（測(cè)序酶） 來源：T7 Phag

30、e 感染的 E.coli 結(jié)構(gòu)：由 2 個(gè)蛋白亞基組成： T7 phage gene 5 蛋白 + 宿主硫氧蛋白 活性： 53聚合，持續(xù)反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)，所以合成的 DNA 鏈長(zhǎng)。故在 DNA 測(cè)序中很優(yōu)越。 35外切，是 DNA 聚合酶的 1000倍。第五十一張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用途 復(fù)制較長(zhǎng)的模板，在測(cè)序中可讀出較長(zhǎng)的序列 用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。 與 TDNApol一樣，平齊粘性末端。 定點(diǎn)突變中互補(bǔ)鏈的合成。53 35第五十二張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月修飾的 T7DNA 聚合酶(測(cè)序酶) 來源： 天然 TDNA 聚合酶經(jīng)修飾處理 結(jié)構(gòu)： 同T

31、聚合酶。 用還原劑、分子氧、低濃度 Fe+與酶保溫幾天，可使Phage T7 gene5 蛋白 N- 端35外切酶活性中心失活 (O- 修飾)。 即：53聚合酶作用提高，持續(xù)性長(zhǎng)。3 5外切作用下降 99% 以上。 第五十三張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus) 來源：從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種 結(jié)構(gòu)：?jiǎn)蝸喕?MW = 94,000 d。 活性：聚合最適溫度為 75-80，不具35外切酶活性，具53外切活性 。 用途： PCR 反應(yīng)。 測(cè)序，高溫下進(jìn)行 DNA 合成可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。第五十四張，PPT共六十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月末端轉(zhuǎn)移酶 (不依賴模板的 DNA 聚合酶) 來源：只在前淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分化早期階段中存在的罕見的 DNA 聚合酶 (Chang 和Bollum,1986)。 結(jié)構(gòu) ：MW = 60,000 d. 活性：催化 dNTP 摻入 DNA 3-OH 末端，形成同聚物末端；反應(yīng)不需模板 DNA，需 Co2+ 用途： 克隆DNA片段時(shí)加上互補(bǔ)同聚物末端，便于與載體連接。 末端標(biāo)記第五十五張，PPT共六十