中性pH條件下化能異養(yǎng)硝酸鹽還原菌對(duì)亞鐵離子的好氧與厭

1、中性 pH 條件下化能異養(yǎng)硝酸鹽還原菌對(duì)亞鐵離子的好氧與厭氧氧化Arch Microbiol1998, 169:159-165IF= 1.975摘要：百分之九十的厭氧富集培養(yǎng)都出自于一些淡水沉積物試樣以及一些海洋沉積物，在pH 7.2 、 30條件下下，沉積物中的亞鐵離子在硝酸鹽和有機(jī)輔助物的礦物媒介中被氧化。厭氧硝化的亞鐵氧化是一個(gè)生物過程。從苦咸水沉積物中分離出的一種微生物（HidR2 ，運(yùn)動(dòng)型不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陰性棒狀菌），進(jìn)一步研究在醋酸鹽環(huán)境中對(duì)亞鐵離子的氧化作用。在微量醋酸鹽 （0.21.1 mM ）環(huán)境中，pH 7.2 、30條件下，HidR2 菌能厭氧和好氧氧化0.74.9mM

2、的亞鐵離子， 其用于生長(zhǎng)的能量來自于亞鐵離子的厭氧硝化氧化，鐵氧化比率是一個(gè)常數(shù)，取決于醋酸鹽的量的給予。中性條件下硝酸鹽厭氧氧化亞鐵離子的能力似乎是嗜溫反硝化細(xì)菌的共有特性。由于依賴硝酸鹽的鐵離子氧化關(guān)閉沉積物缺氧區(qū)的鐵循環(huán)、鐵離子的好氧氧化促進(jìn)含氧區(qū)內(nèi)的二價(jià)鐵再氧化為三價(jià)鐵，這兩個(gè)過程都增加了鐵離子在自然沉積物的有機(jī)質(zhì)循環(huán)轉(zhuǎn)化中作為過渡電子載體的重要性。關(guān)鍵詞： 鐵氧化亞鐵離子高鐵離子硝酸還原作用沉積物引言鐵元素是地殼中含量最豐富的元素之一，也是含量第二豐富的金屬元素。由于其低水溶性，鐵氧化物在水環(huán)境中通常以沉淀形式存在，如復(fù)雜的非晶形或晶體結(jié)構(gòu)(Cornell andSchwertman

3、n 1996) 。三價(jià)鐵離子能夠被異養(yǎng)菌還原為二價(jià)鐵離子(Lovley 1991)，在有氧條件下，亞鐵離子可以在低 pH 值中被嗜酸細(xì)菌如氧化亞鐵硫桿菌再次氧化(Blakeet al. 1993) ，或者在近中性環(huán)境里，被鐵銹色披毛菌氧化 (Hallbeck et al. 1993) ，這兩種細(xì)菌都是從氧化還原反應(yīng)中獲取能量而生長(zhǎng)。Fe3+/Fe2+的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位為 +770 mV ，但是在自然環(huán)境中其實(shí)際的氧化還原電位很大程度上取決于 pH 值的變化 (Widdelet al. 1993) 。在 pH 7的碳酸氫鹽環(huán)境下，F(xiàn)eOOH/FeCO 3的氧化還原過渡電位 E值約為 +200 m

4、V 。在較低的氧化還原電位下， 亞鐵離子也能夠充當(dāng)給電子體， 從而在厭氧環(huán)境中發(fā)生還原反應(yīng)，最近有研究者可以分離和描述能利用亞鐵離子作為電子供體的不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(Widdel et al. 1993; Ehrenreich and Widdel 1994) 硝酸鹽異化作用，最近報(bào)道了一種嗜溫細(xì)菌。+200 mV 下的釋放電子也可以用作微生物的 (Straub et al. 1996) 和一種極端嗜熱的古細(xì)菌(Hafenbradl et al. 1996) 都具有這種新陳代謝功能。這一過程將鐵循環(huán)和氮循環(huán)聯(lián)系上，因此也顯示了微生物厭氧環(huán)境中鐵離子作為電子受體的重要性。 本文主要研究在兼性厭氧硝酸

5、還原菌輔助作用下亞鐵離子的氧化過程。材料和方法2.1 微生物的來源由于采取加富培養(yǎng)，各種沉積物試樣被作為接種源，有淡水源（ Vorsee,Mittlerer Buchensee,and Lake Constance,Germany）、海水源（ Venice, Italy; Ameland and Groningen,Netherlands ） 、鹽水源（ Hiddensee,Germany）以及市政污水處理中使用的活性污泥源（ Ko nstanz,Germany）。2.2 培養(yǎng)介質(zhì)和培養(yǎng)方法對(duì)于淡水和海水中細(xì)菌的加富培養(yǎng)，使用在缺氧條件下的碳酸氫鹽緩沖溶液作礦質(zhì)媒介，且加入 1mM 的硫酸鹽作

6、為硫源，不需加還原劑，NaCl 和 MgCl 2的濃度則與微生物本身的環(huán)境相適應(yīng)，淡水中NaCl 和 MgCl2 6H2O 的量分別為 1.0 g 和 0.4 g，鹽水中為 7.0 g 和1.0 g海水中則為 20.0 g和 3.0g。經(jīng)高壓滅菌， N 2/CO2 (80:20, v/v) 冷卻后，每升溶液中分別加入 1ml微量元素溶液 SL9(Tschech and Pfennig 1984)和 7-維生素溶液 (Widdel and Pfennig 1981)，并將 pH 調(diào)至 7.2,。而對(duì)于需氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基仍和上述方法一樣，所不同的是緩沖溶液由羥乙基哌嗪乙硫磺酸所替代。2.3 富集

7、與分離將 50ml 高壓滅菌后的培養(yǎng)基裝入120ml 規(guī)格的血清瓶中，用丁基橡皮塞密封好，在缺氧條件下往里加入約 5ml的接種體。并無菌地向基底分別注入濃度為4mM 硫酸亞鐵和 5mM硝酸鹽。每個(gè)接種體均在pH為 6.5、 7.0、 8.0，溫度為 16和30下富集培養(yǎng)。培養(yǎng)周期為24周，以棕色銹狀沉淀形成為一個(gè)周期?？嘞趟囵B(yǎng)的細(xì)菌的純化是用的瓊脂稀釋法(Pfennigand Tr per 1981)： 60下向 25ml的試管中加入 3ml 3% （w/v ）的瓊脂溶液，再加入8 mM硫酸亞鐵溶液，小心混勻，然后，加入 7ml 42 預(yù)熱的含5 mM 硝酸鹽培養(yǎng)基，得到的亞鐵離子最終濃度為

8、4 mM 。每根稀釋后的試管都經(jīng)過密封、 接種、 水域冷凝以及 N2/CO2(80:20, v/v) 氣體吹掃， 最后置于避光的 30恒溫箱中培養(yǎng)。在進(jìn)入液體培養(yǎng)基前，微生物都是在瓊脂上生長(zhǎng)繁殖的。淡水和海水微生物的純培養(yǎng)在平板基上分離。平板基的基質(zhì)也是上述培養(yǎng)基加入0.01M丙磺酸作為緩沖溶液、1.5% （ w/v ）的瓊脂、5mM 硝酸鹽和 3 mM 醋酸鹽。在 30，N2/CO 2(80:20, v/v) 氣氛下進(jìn)行避光平板接種。培養(yǎng)好的菌種轉(zhuǎn)移到呈有淡水培養(yǎng)基的血清瓶60ml ）中。只有在瓶子中進(jìn)行亞鐵離子氧化的微生物才在瓊脂板上顯示多于兩條條紋從而得以純化，并且將其轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中

9、培養(yǎng)。在含有礦物質(zhì)元素和 0.2%的酵母膏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的微生物在顯微鏡下進(jìn)行純化檢查。培養(yǎng)期間需定期用顯微鏡檢查微生物是否被污染。 檢測(cè)鞭毛是否形成， 使用的方法是布雷登 -戈登堡銀侵染法。2.4 增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌在裝有 300ml 培養(yǎng)基的瓶（500ml ）中培養(yǎng)，未接種的空白試驗(yàn)瓶在相同條件下培養(yǎng)至少兩個(gè)月， 但是始終未見到有能氧化二價(jià)鐵離子的微生物產(chǎn)生。經(jīng)過震蕩后的樣品放入具塞瓶中， 用N 2/CO2 (80:20, v/v) 氣預(yù)吹，然后轉(zhuǎn)移到鹽酸或者磷酸緩沖溶液中準(zhǔn)備下一步分析。為保證在氧氣梯度管中的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，將 4ml 缺氧培養(yǎng)基裝入 22ml試管中，培養(yǎng)基中含有1.5% (w/v

10、) 瓊脂糖、 15 mM 亞鐵離子、 1 mM 醋酸鹽。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，等第一層凝結(jié)后，再加入第二層培養(yǎng)基 （ 0.5% (w/v) 瓊脂糖），將微生物接種在這一層上。 等到第二層氮?dú)獗Ｗo(hù)下凝固好以后再往上面加入1ml 原培養(yǎng)基不含瓊脂糖，為的是防止第二層瓊脂糖的干結(jié)。試管用鋁蓋輕輕蓋上，垂直放入暗箱中在30下，振蕩培養(yǎng)（80rpm）。以上所有試驗(yàn)重復(fù)一遍2.5 分析方法亞鐵離子的量用亞鐵嗪分光光度法來測(cè)定(Stookey 1970) ?？傝F離子的濃度測(cè)定也是用同樣的方法即加入鹽酸羥胺將所有的鐵離子都還原成亞鐵離子態(tài)(Stookey1970) 。三價(jià)鐵離子則有上述二者差值得到。為得到亞硝酸鹽的含

11、量，樣品與一體積500mM 的磷酸緩沖溶液在厭氧環(huán)境下混合， 并在室溫下反應(yīng)15分鐘，然后在離心機(jī)上用最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。 用1ml1M 的鹽酸將其又恢復(fù)粒子態(tài)。這樣處理可以避免亞硝酸鹽在分析前和分析過程中被亞鐵離子所氧化。如果試樣中含有超過1mM 的亞硝酸鹽，則這個(gè)過程必須重復(fù)至少兩次。由于鐵離子分析是在梯度管中進(jìn)行的，所以瓊脂糖要用刀片切成2mm后的薄片并加入 1ml 5M 的鹽酸。在 40水浴中靜置 15分鐘后，薄片已被酸化成液體，鐵離子在上述過程中被測(cè)量完畢。硝酸鹽和亞硝酸鹽用帶有格魯姆陰離子交換柱(Grom, Herrenberg, Germany)的高效液相色譜來進(jìn)行定量分析，在2

12、20nm下進(jìn)行吸收檢測(cè)。為了抑制鐵離子和亞硝酸鹽的相互反應(yīng)，并且為保護(hù)色譜柱， 含鐵樣品中得加入磷酸緩沖溶液，上清液用于硝酸鹽亞硝酸鹽的檢測(cè)。這種方法的對(duì)亞硝酸鹽的檢出限大約是30 M。醋酸鹽用氣相色譜（GC6000 Vega Series 2; Carlo Erba, Milan, Italy）分析，使用填充柱（2 m2mm; 60/80 Carbopack C/0.3% carbowax 20 M/0.1% H3PO4），火焰離子檢測(cè)器。為了保護(hù)柱子， 醋酸鹽試樣也按上述方法準(zhǔn)備。氧化二氮也用上述氣相色譜分析，使用的填充柱2 m2 mm; 60/80 Carbosieve SII (Sup

13、elco, Bellefonte, Pa., USA)和檢測(cè)器（熱導(dǎo)池檢測(cè)器）不一樣。根據(jù) Hall和 Aller(1992) ，銨鹽用流動(dòng)注射分析。蛋白質(zhì)由以下分析：測(cè)定含鐵樣品中蛋白質(zhì)的含量，需要準(zhǔn)備含有試樣中相同鐵量的蛋白質(zhì)標(biāo)樣，為的是測(cè)定蛋白質(zhì)化學(xué)分析中與鐵離子的可能反應(yīng)。由于幾種HidR2 菌所對(duì)應(yīng)的不同的光密度的蛋白質(zhì)含量與干重呈一種相關(guān)關(guān)系，根據(jù)這種關(guān)系，可以來計(jì)算蛋白質(zhì)的干重。梯度管中的氧含量用三維顯微操作器驅(qū)動(dòng)氧微電極而測(cè)定。3 結(jié)果3.1 富集培養(yǎng)在 710天的培養(yǎng)下， 除了威尼斯海峽采集的沉積物以外， 所有的富集培養(yǎng)都形成了棕色銹狀沉淀。 通過化學(xué)分析， 這些沉淀都被確定

14、為鐵的氫氧化物， 而在未富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基里都未發(fā)現(xiàn)亞鐵的氧化作用。 經(jīng)過三到四次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)， 需加入醋酸鹽或者琥珀酸鹽作為有機(jī)補(bǔ)給物以維持亞鐵離子的氧化作用環(huán)境。 只有從格羅寧根市海洋沉淀物中富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基不用加入補(bǔ)給物而能不斷氧化亞鐵離子， 即使重復(fù)轉(zhuǎn)移一年以上也能進(jìn)行反應(yīng)。 在比較所有富集培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)， 無論是在 16或 30還是 pH為 6.5或8，亞鐵離子的轉(zhuǎn)化率和潛伏程度都沒有明顯的改變。3.2 純培養(yǎng)的特征從所有能發(fā)生亞鐵離子氧化反應(yīng)的富集培養(yǎng)中來看，純培養(yǎng)獨(dú)立的顯示了亞鐵離子厭氧氧化過程中醋酸鹽是作為有機(jī)補(bǔ)給物而硝酸鹽則是作為電子受體。 從波羅的海沉積物中分離出來的 HidR2 菌

15、種將被作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。圖1HidR2 菌在醋酸鹽和硝酸鹽厭氧生長(zhǎng)中的相差顯微鏡照片（圖中橫杠表示10微米）HidR2 菌屬于革蘭氏陰性，不產(chǎn)孢子的桿菌，大小為36 1m（圖 1），單極鞭毛運(yùn)動(dòng)型，對(duì)氧化酶和過氧化氫酶產(chǎn)生極性。通過相差顯微鏡觀察到細(xì)胞兩端有微小深色包涵體，用三氯甲烷處理后， 這些包涵體消失， 可能是由于聚羥基脂肪酸的富集產(chǎn)生。 在過量醋酸鹽（ 3 mM ）中培養(yǎng)后， HidR2 菌每一批能產(chǎn)生約 1050個(gè)細(xì)胞。在含有亞鐵離子、醋酸鹽和硝酸鹽的液體培養(yǎng)基中，通過 4,6-二脒基 -2- 苯吲哚鹽酸染色法，可以發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞都含有絮狀的三氧化鐵或者肉眼可見的姜鐵礦，但氫氧

16、化鐵并非包裹在細(xì)胞外部。在含醋酸鹽和硝酸鹽的瓊脂培養(yǎng)基中，HidR2 菌形成的則是白色松軟的菌落。在在含亞鐵離子、醋酸鹽和硝酸鹽的瓊脂培養(yǎng)基里，形成的是深褐色的邊緣不規(guī)則的球形菌落。此菌的溫度適宜范圍是540，最適溫度是33， pH 范圍在 5.59.5 之間，最適pH 是 7.5。在含硝酸鹽、亞硝酸鹽或者氧化二氮的厭氧環(huán)境中或者在好氧環(huán)境中與氧反應(yīng)的時(shí)候，HidR2 菌始終是作為電子受體。且在含有硫酸鹽、 延胡索酸鹽或無定形氫氧化鐵（作為電子受體） Lovley and Phillips 1986以及醋酸或琥珀酸鹽（作為給電子體）的培養(yǎng)基中，HidR2 菌不能生長(zhǎng)。經(jīng)測(cè)試和氧化后的給電子體有

17、葡萄糖、果糖、木糖、樹膠醛糖、丙酸鹽、丁酸鹽、L- 乳酸鹽、異丁酸鹽、琥珀酸鹽、乙二醇、乙醇、甘氨酸和酵母膏；異戊酸、苯酸鹽、甲醇和氨則不能被氧化。3.3 HidR2菌對(duì)亞鐵離子的厭氧氧化作用在沒有有機(jī)補(bǔ)給物的厭氧環(huán)境中，HidR2 菌不能生長(zhǎng)也不能對(duì)亞鐵離子的氧化進(jìn)行有效的測(cè)量，而加入醋酸或者琥珀酸以后效果就發(fā)生了明顯的變化。圖 2 a， b在pH 6.7 、30，含有硝酸鹽和醋酸鹽的培養(yǎng)基中，HidR2 菌對(duì)亞鐵離子的厭氧硝化氧化作用，亞硝酸鹽未檢測(cè)到（檢出限為30M ）。 a.不含亞鐵離子；b.含有亞鐵離子。：蛋白質(zhì)：硝酸鹽：醋酸鹽：亞鐵離子：鐵離子在 pH 6.7 、30條件下， 醋酸

18、鹽作為補(bǔ)給物，圖2記錄了 HidR2 菌對(duì)亞鐵離子的厭氧硝化氧化作用， 并且與不含亞鐵離子的做了對(duì)比。在含有亞鐵離子的培養(yǎng)基里，細(xì)胞以指數(shù)方式生長(zhǎng)，這種速度能持續(xù) 45個(gè)小時(shí)。隨著醋酸鹽的消耗， 大約 14天左右細(xì)胞仍以兩倍速度增長(zhǎng)，這取決于初始醋酸鹽的濃度值。 在沒有亞鐵離子的培養(yǎng)基里， 細(xì)胞以指數(shù)形式增長(zhǎng)只能維持11個(gè)小時(shí)。從表 1可以看出， HidR2 菌在醋酸鹽和亞鐵離子作為底物的情況下，將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為了氮?dú)夂脱趸?，這一點(diǎn)和其他種類的微生物作用一樣。這一過程中并沒有形成氨，因?yàn)榘辈荒茉趨捬醐h(huán)境中氧化。 在高壓滅菌處理后， 同樣的試驗(yàn)方法沒有得到亞鐵離子氧化和蛋白質(zhì)量增加的結(jié)果。表

19、1總結(jié)了厭氧條件下含和不含亞鐵離子的情況，指出亞鐵離子的氧化并不完全，添加的亞鐵離子只有近 90%被氧化。通過加入 1mM 的醋酸鹽或者 5mM 的亞硫酸鐵，也不能改變這一比例，這表明細(xì)胞無法利用剩余的亞鐵離子。為證明醋酸鹽對(duì)亞鐵離子氧化程度的影響，設(shè)計(jì)了一系列不同醋酸鹽濃度的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（圖 3）。約每增加 1mM 醋酸鹽能夠穩(wěn)定地影響鐵離子氧化的量，每消耗 1mol 的醋酸鹽就會(huì)反應(yīng) 4mol的亞鐵離子。當(dāng)超過供給鐵離子的 90%以后，即使再增加醋酸鹽的量，鐵離子也不會(huì)再被氧化。3.4 HidR2 菌對(duì)亞鐵離子的好氧氧化作用圖 4給出了在含有梯度氧濃度和亞鐵離子以及少量醋酸鹽的半固體培養(yǎng)基中，

20、通過 HidR2 菌新陳代謝對(duì)鐵和氧的形成的影響。將未接種的試管中也進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)，為的是觀察生物和化學(xué)氧化鐵離子的不同。微生物在空氣環(huán)境中培養(yǎng)4周，在培養(yǎng)后，在瓊脂糖下面形成了一片一片表面光滑且多層薄而緊密的多層含鐵層。而在對(duì)照管內(nèi)并沒有形成上述一樣的層面， 而是形成的橘色的鐵離子層，比上述管內(nèi)的層面要淺，但是更寬。 化學(xué)分析表明：相對(duì)于未接種 HidR2 菌的化學(xué)氧化而言，三價(jià)鐵沉淀物的最大條帶在瓊脂培養(yǎng)基中位置要深很多，其氧分壓也要低很多，因此可以證實(shí)肉眼觀察到的現(xiàn)象：二價(jià)鐵可被 HidR2 菌有氧氧化。顯然， HidR2 菌細(xì)胞能將大部分三價(jià)鐵固定到明顯的一層，這一點(diǎn)在自然沉積物中也

21、有發(fā)現(xiàn)。表 1 HidR2 菌在含有醋酸鹽和硝酸鹽的培養(yǎng)基中，加鐵和不加鐵的厭氧生長(zhǎng)情況下，其生長(zhǎng)化學(xué)當(dāng)量比和底物轉(zhuǎn)化情況。每一列代表著添加各種濃度的醋酸鹽和亞硫酸鐵的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。低濃度醋酸鹽對(duì)應(yīng)著低的細(xì)胞產(chǎn)率（第一、二列）不能給出可靠的蛋白質(zhì)形成試驗(yàn)；相反地，在高濃度醋酸情況下的實(shí)驗(yàn)（第三、四列）下，表中也沒有關(guān)于干重的計(jì)算。所以用于細(xì)胞合成的電子也沒有考慮在平衡計(jì)算中（第一、二列）nd表示未檢測(cè)到） 。a醋酸鹽的量是以 C4H7O3形式的干重計(jì)算，根據(jù)方程：+-17acetate+11H 8C4H7O3+2HCO3+4OH醋酸鹽氧化的量是根據(jù)醋酸消耗量減去醋酸累計(jì)量電子的回收率是用消耗硝酸鹽

22、氧化為氮?dú)夂筒糠盅趸獪p少的電子除以從醋酸鹽氧化得到的電子（第四列）或者是從加了鐵鹽的醋酸鹽氧化中的電子（ 13列）得到的。 由于第一、 二列沒有計(jì)算出醋酸的氧化，所以可以得出醋酸是100%的消耗掉。圖 3 培養(yǎng)基中含有 8mM 亞硫酸鐵和 5mM 硝酸鹽以及各種濃度的醋酸鹽條件下，HidR2 菌對(duì)亞鐵的氧化和醋酸的消耗情況。在pH=6.8 ，30下避光培養(yǎng) 3周。3.5 化學(xué)方法亞鐵氧化作為對(duì)照試驗(yàn)化學(xué)方法氧化亞鐵離子的條件和HidR2 細(xì)菌的生長(zhǎng)條件采用的是一樣的，由于分子氧能很容易地氧化亞鐵， 例如不包含培養(yǎng)液的條件就可以檢查分子氧通過穿透橡膠塞導(dǎo)致鐵產(chǎn)生化學(xué)性氧化。這種方法顯示了在上

23、述條件下培養(yǎng)6周也不會(huì)檢測(cè)到亞鐵離子的氧化。向 pH 為 6.7含 8mM 亞鐵離子的厭氧培養(yǎng)基中加入5mM 的亞硝酸鹽可以加快亞鐵離子的氧化速度。 在4天內(nèi)，亞鐵離子的氧化速度為8m/h，而要消耗約 0.8mM 的亞硝酸鹽。 而當(dāng)加入1mM 和 0.3mM 的亞硝酸鹽時(shí)，在相同條件下均未檢測(cè)到亞鐵離子的氧化作用。圖 4 a，b 在30搖床上培養(yǎng) 30天后，瓊脂氧 - 二價(jià)鐵梯度管中三價(jià)鐵和氧的變化。a是 HidR2 菌的培養(yǎng)情況；b是對(duì)照實(shí)驗(yàn)。條狀代表三價(jià)鐵，圓點(diǎn)代表氧。4 討論在本文中， 已經(jīng)很詳細(xì)的介紹了脫氮細(xì)菌在pH 7.2 和 30下加入少量有機(jī)補(bǔ)給物而觀察在厭氧和好氧條件下對(duì)亞鐵的

24、氧化作用。鑒于在pH 7.2 下亞鐵離子有很強(qiáng)的親氧能力，控制氧條件是很有必要的，主要是要區(qū)分生物氧化和非生物氧化亞鐵離子。一定要注意避免氧從塞子進(jìn)入培養(yǎng)基中，并且亞硝酸鹽也要在培養(yǎng)過程中隨時(shí)檢測(cè)，因?yàn)樵谙跛猁}反應(yīng)過程中亞硝酸鹽可能富集，而它可以促進(jìn)亞鐵離子的化學(xué)氧化(Komatsu et al.1977; Moraghan and Buresh 1977; Christianson and Cho 1983; Brons et al. 1991)。由于HidR2菌在有機(jī)輔助物存在下能形成大量的三價(jià)鐵離子， 所以我們要排除由于硝酸鹽還原產(chǎn)生的亞硝酸鹽和氧化二氮的化學(xué)氧化的干擾，對(duì)照試驗(yàn)可以得出

25、以下結(jié)論：氧氣穿透橡膠塞進(jìn)入培養(yǎng)基中氧化亞鐵這個(gè)假設(shè)不成立，因?yàn)樵跊]有微生物中的對(duì)照瓶中經(jīng)過 6周都沒有檢測(cè)到鐵離子氧化作用。2. 在HidR2 菌的培養(yǎng)基中，亞硝酸鹽的促進(jìn)作用也不成立，因?yàn)楦哂?30 M （檢出限）的濃度下也沒有被檢測(cè)到； 如果亞硝酸鹽濃度在幾個(gè)毫摩下才會(huì)對(duì)亞鐵離子的化學(xué)氧化產(chǎn)生影響，眾所周知，這種情況只會(huì)發(fā)生在一些分批培養(yǎng)的脫氮?jiǎng)┲小?. 氧化二氮的對(duì)亞鐵氧化的影響同樣可以被排除，et al. 1996)，相當(dāng)于 2mmol/l ，不會(huì)對(duì)鐵產(chǎn)生氧化。因?yàn)闈舛葹?0ml/l 的氧化二氮(Straub由于所有化學(xué)氧化實(shí)驗(yàn)我們都按照生物實(shí)驗(yàn)條件來開展的，可以證明厭氧硝酸鹽化的亞

26、鐵離子氧化作用是一個(gè)生物催化反應(yīng)。我們證明了 HidR2 菌能夠利用從亞鐵離子氧化過程中得到的電子用于其異氧新陳代謝，從而獲取能量。這一結(jié)論是基于HidR2 菌的產(chǎn)率比較，在含有亞鐵離子的培養(yǎng)基的產(chǎn)率要比只含醋酸鹽的產(chǎn)率高55%（表 1）。HidR2 菌的質(zhì)量仍然是隨著醋酸鹽的減少而增加（圖2）的也能支持這一結(jié)論。很明顯，醋酸鹽在HidR2 菌的細(xì)胞合成過程是必不可少的，此微生物不是自養(yǎng)型的。 然而，醋酸鹽并不是完全同化于細(xì)胞中，部分醋酸鹽也反應(yīng)在了多余的亞鐵鹽中。當(dāng)以足量醋酸鹽給予反應(yīng)時(shí)，其氧化反應(yīng)和鐵的是同時(shí)進(jìn)行的，且以1:4的速率進(jìn)行著（圖 3）。顯而易見的是， 醋酸鹽氧化所提供的電子用

27、于醋酸吸收，這些電子不能在氧化鐵時(shí)被細(xì)胞所還原， 可能是由于缺乏適合的反電子傳遞系統(tǒng)。含每摩爾醋酸的細(xì)胞產(chǎn)量 （干重 14g）和每摩爾醋酸加了4 摩爾亞鐵的細(xì)胞產(chǎn)量（19g ）比較可以看出，在細(xì)胞新陳代謝機(jī)制（1.75g/mol e-）中，醋酸電子（ E0mV ）要比亞鐵氧化（ 1.0g/mole-， EmV）產(chǎn)生的電子效用高兩倍以上。這一結(jié)論可以很好的解釋所有的能量都由硝酸鹽的電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)0mV 所有計(jì)算都是基于 Thauer et al. (1977) 。生2 NO 3 /N 2的E當(dāng)在含有亞鐵離子的厭氧環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)HidR2 菌生長(zhǎng)緩慢，但這一現(xiàn)象并不一定是與鐵氧化代謝有關(guān)， 可能是由于

28、過量亞鐵中毒的現(xiàn)象，或者是由于磷酸鹽或其他微生物營(yíng)養(yǎng)物的低利用效率，也可能是這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與鐵發(fā)生了沉淀反應(yīng)(Hughes and Poole 1991)。關(guān)于鐵厭氧氧化的生化作用仍然有幾個(gè)公開的問題。要觀察能量節(jié)省需要一個(gè)質(zhì)子能夠穿過細(xì)胞膜而轉(zhuǎn)移出來，我們并不知道亞鐵離子是在細(xì)胞的那個(gè)部位氧化的，在亞硝酸鹽和氧化二氮存在的條件下，如果亞鐵氧化定位在胞外質(zhì)的話，問題就是形成的氫氧化鐵是如何轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中的。 例如， 亞鐵離子還能夠在細(xì)胞外面發(fā)生氧化反應(yīng)。這就需要一個(gè)電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)穿過胞外質(zhì)（如細(xì)胞色素）Stouthamer 1991; Ferguson 1994。像這種電子載體已經(jīng)被認(rèn)為是嗜酸厭氧鐵氧化的氧化劑(Blakeet al. 1993)。因?yàn)?HidR2