大專生物化學(xué)專題一膠原蛋白的提取市公開課金獎市賽課一等獎?wù)n件

1、專題一 膠原蛋白提取生物化學(xué)實用技術(shù)章宇寧 .3第1頁膠原蛋白是一個極其主要結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動物骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。 占哺乳動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量25%30%，相當(dāng)于體重6%最少有19種不一樣類型膠原蛋白概述第2頁 一個白色、不透明、無支鏈纖維蛋白質(zhì)通常由3 條多肽鏈組成，每條鏈都有左手螺旋結(jié)構(gòu)，三條鏈繞成右手超螺旋。螺旋區(qū)段之外部分常發(fā)生各種交聯(lián)。每一條鏈都有若干個經(jīng)典氨基酸序列(-Gly-X-Y-) n 。X、Y 均表示任意氨基酸,X 通常是脯氨酸(Pro) , Y 通常指羥脯氨酸(Hyp )膠原蛋白中缺乏Cys和Try 膠原蛋白組成與結(jié)構(gòu)第3頁制造食品止血，促進傷口愈

2、合作為可吸收支架材料、縫合材料作為藥品載體局部整形膠原蛋白應(yīng)用第4頁從膠原蛋白較為豐富組織（比如皮膚和肌腱）中提取傳統(tǒng)起源：豬牛羊皮新興起源：魚鱗等問題一：怎樣從原料中提取蛋白？問題二：怎樣從蛋白中分離膠原蛋白？問題三：怎樣檢驗得到蛋白是膠原蛋白？膠原蛋白提取第5頁前處理粗分級（粗提）細分級（分離純化）問題一：蛋白提取步驟？作業(yè)一：某一特定蛋白質(zhì)分離提純普通程序是什么？第6頁破碎組織細胞，使蛋白更加好地與外界條件接觸盡可能保持蛋白天然構(gòu)象和生物活性注意控制條件必要時加入蛋白保護劑能夠先將某一細胞組分分離出來前處理動物材料：除脂肪組織- 電動搗碎機、勻漿器、 超聲波植物組織：去種皮- 石英砂、玻

3、璃粉細菌細胞：超聲波震蕩、砂研磨、高壓、溶菌酶第7頁稱取新鮮豬皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液對其進行脫脂后切除皮下脂肪，去毛并細切。將用蒸餾水洗滌后組織小塊放入高速組織搗碎機中搗碎成糊狀（1r/min），用含4.5mol/L NaCl0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）充分洗滌以去除脂質(zhì)及血清等成份，低溫離心（8000r/min，30min，4OC）。膠原蛋白提取前處理第8頁第一步：將蛋白與材料分開，使其進入溶液中酸溶堿溶鹽溶酶解粗分級注意依據(jù)所要提取蛋白質(zhì)性質(zhì)選擇適當(dāng)粗分級方法第9頁提取膠原蛋白常使用溶劑是中性鹽溶液(0.152mol/L NaCl)或是稀醋酸溶

4、液。前者只適合提取組織中最新合成膠原以及交聯(lián)度能夠忽略膠原。稀酸，比如0.5mol/L醋酸，檸檬酸緩沖液，pH值在23之間鹽酸溶液，要比中性鹽溶劑更為有效，但仍只能溶解出組織中大約2%膠原。利用10%NaOH溶液共同處理組織48h左右，能夠溶解出大部分膠原。與不溶性膠原結(jié)合在一起脂肪被皂化，非螺旋端肽被切除，膠原纖維瓦解。最終所得膠原大小和分子質(zhì)量，取決于處理時間以及堿濃度。酶能夠?qū)⒛z原蛋白分子端肽切除或部分水解，使之易溶于水膠原蛋白提取粗分級第10頁粗分級第二步：用簡便且處理量大方法去除無機物等雜質(zhì)，得到濃縮蛋白質(zhì)溶液鹽析等電點沉淀法有機溶劑沉淀法超濾如蛋白相互差異較大，也可初步分離目標蛋白

5、 可逆沉淀第11頁鹽析法(中性鹽沉淀法)：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽,使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。慣用中性鹽有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。有機溶劑沉淀法：慣用與水互溶有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等，破壞水膜，使其沉淀。 蛋白質(zhì)等電點：蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零時，所處溶液pH 值即為該蛋白質(zhì)等電點。在等電點時蛋白質(zhì)最不穩(wěn)定，溶解度最小。第12頁超濾法利用含有一定大小孔徑微孔濾膜，對生物大分子溶液進行過濾，使大分子保留在超濾膜上面溶液中，小分子物質(zhì)及水過濾出去，從而到達脫鹽或濃縮目標。第13頁細分級深入分離純化目標蛋白質(zhì)透析超濾凝膠過濾/層析/離子交換色譜密度梯度離心電泳等電聚焦第

6、14頁在粗提膠原蛋白溶液中遲緩加入6mol/L NaOH至pH=7，冷凍離心去除沉淀，在上清液中加入NaCl攪拌，4保留過夜；離心取沉淀，用稀HAc溶解，將溶液裝入透析袋中，用0.1mol/L Hac透析1天，再用蒸餾水透析1天。膠原蛋白提純第15頁透析法第16頁電泳：帶電顆粒在電場中向電荷相反電極移動現(xiàn)象不一樣蛋白質(zhì)顆粒大小、形狀、所帶電荷、等不一樣，在電場中泳動速度各異，因而可聚集形成不一樣條帶，從而到達分離目標。 電泳法第17頁 電泳法第18頁膠原蛋白電泳圖第19頁層析法：離子交換層析法凝膠過濾層析法親和層析法吸附層析法分配層析法第20頁離子交換層析法第21頁原理:依據(jù)離子交換劑與蛋白質(zhì)進行離子交換，再利用適當(dāng)緩沖液洗脫，即可到達分離含有不一樣電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)目標。第22頁凝膠過濾層析法(排阻層析，分子篩層析)第23頁原理： 混合物流經(jīng)裝有凝膠顆粒（凝膠顆粒內(nèi)部含有大量一定大小微孔）層析柱時，大分子不能進入凝膠孔內(nèi)，移動較快，并最先被洗脫出來；小分子能不一樣程度自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過旅程較長，移動速度較慢，最終被洗脫出來。第24頁親合層析法親和蛋白配基第25頁原理：利用某種蛋白質(zhì)能與其對應(yīng)專一性配基進行特異可逆結(jié)合能力（親協(xié)力）來純化生物大分子。第26頁密度