sanger測序培訓(xùn)最終精講

1、sanger測序基因檢測金標(biāo)準(zhǔn)曹尚志sanger測序培訓(xùn)最終精講第1頁sanger測序原理Sanger測序基本流程測序結(jié)果分析 雙脫氧末端終止法引物設(shè)計(jì)試驗(yàn)流程上機(jī)測序怎樣分析結(jié)果問題峰圖分析sanger測序培訓(xùn)最終精講第2頁ddNTP被加到正在合成鏈上，因?yàn)樗?-OH已被氧化，下一個(gè)dNTP5-磷酸基團(tuán)不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止。在引物等延伸反應(yīng)過程中，ddNTP在不一樣位置摻入，產(chǎn)生了一系列不一樣長度新DNA片段。5353一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法sanger測序培訓(xùn)最終精講第3頁一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法sanger測序培訓(xùn)最終精講第4頁二、Sange

2、r測序試驗(yàn)基本流程（以MTHFR(RS1801133)檢測為例）1.依據(jù)rs號得到位點(diǎn)信息及目標(biāo)序列2.引物設(shè)計(jì)3.測序PCR模板制備4. 測序樣品制備5.上機(jī)測序sanger測序培訓(xùn)最終精講第5頁 1.依據(jù)rs號得到位點(diǎn)信息及目標(biāo)序列sanger測序培訓(xùn)最終精講第6頁+2.1 primer primer 5.02.引物設(shè)計(jì)sanger測序培訓(xùn)最終精講第7頁2.2 引物特異性檢驗(yàn) 2.引物設(shè)計(jì)sanger測序培訓(xùn)最終精講第8頁避免3端錯(cuò)配Your Text Here防止熒光標(biāo)識測序引物長度16-25bp，TM值50-65為宜,55最正確測序引物位置防止Poly（A.T）和高GC結(jié)構(gòu)測序引物位置

3、距離位點(diǎn)最多600bp，最少50bp不能使用吞并引物測序引物純度（PAGE純化方式）2.3 設(shè)計(jì)引物還需注意sanger測序培訓(xùn)最終精講第9頁3.測序PCR模板制備依據(jù)合成回來引物濃度稀釋，普通工作液10umol/ul(4保留)，母液100umol/ul（-20保留）1.PCR擴(kuò)增三步法：變性-退火-延伸2.退火溫度：(Ftm+Rtm)/2-53.延伸時(shí)間：1kb=1min依據(jù)設(shè)計(jì)好參數(shù)，設(shè)置使用PCR儀器擴(kuò)增.3.1 PCR擴(kuò)增稀釋引物 設(shè)計(jì)方案pcr儀擴(kuò)增sanger測序培訓(xùn)最終精講第10頁 依賴于PCR反應(yīng)優(yōu)化程PCR產(chǎn)物質(zhì)量 選擇最正確純化方法純化意義純化（試劑盒）方式選擇1.柱純化：

4、用于特異PCR產(chǎn)物純化或存在100bp非特異產(chǎn)物純化 (如：引物二聚體)2.切膠回收：可用于任何質(zhì)量PCR產(chǎn)物純化切下條帶，去除非特異PCR產(chǎn)物和引物二聚體3.2 PCR產(chǎn)物純化去除PCR反應(yīng)液殘留1.殘留引物：確保引物特異性，防止多重測序2.殘留dNTP:以保持dNTPs / ddNTPs最正確百分比3.鹽成份：防止抑制測序酶活性4.非特異PCR產(chǎn)物：防止擴(kuò)增出同源性區(qū)域sanger測序培訓(xùn)最終精講第11頁測序PCR 酒精/EDTA/NaAc法：去除殘留BigDye Terminator(染料峰) 測序產(chǎn)物脫鹽 純化好測序產(chǎn)物比較穩(wěn)定測序產(chǎn)物純化4.測序樣品制備測序PCR（以回收PCR產(chǎn)物為

5、模板）：96 1 min -(96 10 sec - 50 5 sec - 60 4 min) x 25循環(huán)-4 保溫sanger測序培訓(xùn)最終精講第12頁sanger測序培訓(xùn)最終精講第13頁測序PCR與普通PCR區(qū)分sanger測序培訓(xùn)最終精講第14頁5. 上機(jī)測序pcr擴(kuò)增儀器中95變性4min。.5.1 測序樣品變性5.2 上機(jī)操作sanger測序培訓(xùn)最終精講第15頁三、 測序結(jié)果分析怎樣看測序結(jié)果怎樣得到位點(diǎn)基因型常見峰圖介紹確保測序結(jié)果準(zhǔn)確性sanger測序培訓(xùn)最終精講第16頁峰圖判斷三要素：電泳圖(Electropherogram)、峰圖(Raw)、QV值峰圖 電泳圖/QV值1.怎么

6、看峰圖（分析軟件Sequence Analysis）sanger測序培訓(xùn)最終精講第17頁Raw：峰圖Electropherogram：電泳圖sanger測序培訓(xùn)最終精講第18頁QV值QV值越高，讀圖越準(zhǔn)確。QV值為藍(lán)色，表示可信。QV值為黃色，表示不準(zhǔn)確，需要人工判讀。QV值為紅色，表示不可信QV值sanger測序培訓(xùn)最終精講第19頁依據(jù)得到位點(diǎn)信息，將位點(diǎn)3保守序列（10個(gè)堿基左右），在軟件中Chromas查找，前面即為突變基因型。PS:假如是反向引物測序需要將測序結(jié)果反向互補(bǔ)2.怎樣得到位點(diǎn)基因型（分析軟件Chromas）sanger測序培訓(xùn)最終精講第20頁正常及無信號、信號弱測序峰圖樣品

7、內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖測序儀器影響及測序峰圖純化原因影響及測序峰圖引物質(zhì)量影響及測序峰圖3.常見峰圖介紹及分析sanger測序培訓(xùn)最終精講第21頁正常峰圖（有完整峰型、單一峰尖銳獨(dú)立、QV值基本上為藍(lán)色)Electropherogram：Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第22頁無信號（無完整峰型、無信號或信號值較低、峰圖雜亂無章、絕大部分不可信）Raw：Electropherogram：sanger測序培訓(xùn)最終精講第23頁信號弱（有較完整峰型、信號值較低、峰圖部分可信）Raw：Electropherogram：sanger測序培訓(xùn)最終精講第24頁正常及無信號測序峰圖樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰

8、圖測序儀器影響及測序峰圖純化原因影響及測序峰圖引物質(zhì)量影響及測序峰圖3.常見峰圖介紹及分析sanger測序培訓(xùn)最終精講第25頁poly（A、T）結(jié)構(gòu)造成后雙峰返回Electropherogram：Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第26頁測序信號中止（二級結(jié)構(gòu)造成）返回Electropherogram：Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第27頁序列結(jié)構(gòu)高GC造成信號衰減返回Electropherogram：Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第28頁正常及無信號測序峰圖樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖測序儀器影響及測序峰圖純化原因影響及測序峰圖引物質(zhì)量影響及測序峰圖3.常見峰圖介紹及分析sang

9、er測序培訓(xùn)最終精講第29頁峰圖出現(xiàn)斷層（可先重跑看是否處理，需要換Buffer）Electropherogram（電泳圖、QV正常）Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第30頁毛細(xì)管堵塞造成拖尾（可先重跑看是否處理，或者清理毛細(xì)管）Electropherogram（展開圖正常）Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第31頁毛細(xì)管堵塞造成寬峰（可先重跑看是否處理，或者清理毛細(xì)管）Electropherogram：Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第32頁正常及無信號測序峰圖樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖測序儀器影響及測序峰圖純化原因影響及測序峰圖引物質(zhì)量影響及測序峰圖3.常見峰圖介紹及分析sanger測序培訓(xùn)最終精講第33頁染料峰（純化操作不規(guī)范或者ddntp過量）返回Electropherogram：Raw：sanger測序培訓(xùn)最終精講第34頁正常及無信號測序峰圖樣