BIORAD脈沖場電泳介紹

1、脈沖場電泳介紹（PFGE）BIORAD脈沖場電泳介紹第1頁一、脈沖場電泳（PFGE）原理二、脈沖場電泳（PFGE）操作流程三、脈沖場電泳（PFGE）應(yīng)用主要內(nèi)容BIORAD脈沖場電泳介紹第2頁脈沖場電泳（PFGE）原理核酸凝膠電泳: 核酸凝膠電泳是重組DNA技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)之一，它能夠按分子量大小對DNA或RNA進行分離。所以，可用于分離、判定和純化DNA或RNA片段，也是許多分子生物學研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析、凝膠回收等等一系技術(shù)技術(shù)基礎(chǔ)。BIORAD脈沖場電泳介紹第3頁慣用核酸凝膠電泳有瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。

2、能夠在水平或垂直電泳槽中進行。 脈沖場電泳（PFGE）原理BIORAD脈沖場電泳介紹第4頁脈沖場電泳（PFGE）原理瓊脂糖凝膠分辨DNA片段范圍為0.2-50 kb之間。聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1-1, 000 bp之間。凝膠濃度高低影響凝膠介質(zhì)孔隙大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。BIORAD脈沖場電泳介紹第5頁濃 度（%）標 準(kb)高強度(kb)低熔點(kb)低黏度低溶點(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.051

3、0.514.00.10.56.00.010.1不一樣類型瓊脂糖分離DNA片段范圍脈沖場電泳（PFGE）原理BIORAD脈沖場電泳介紹第6頁脈沖場電泳（PFGE）原理丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）二甲苯氰FF溴酚藍3.510004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512DNA在聚丙烯胺凝膠中有效分離范圍BIORAD脈沖場電泳介紹第7頁脈沖場電泳（PFGE）原理 在凝膠電泳中或后，加入溴化乙錠（Ethidium bromide，EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而

4、快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g微量 DNA，也能夠被清楚地檢測出來。BIORAD脈沖場電泳介紹第8頁普通核酸電泳應(yīng)用：1、分子克隆-PCR產(chǎn)物特異性確實認2、RNA完整性確實認（定量PCR驗證步驟）脈沖場電泳（PFGE）原理BIORAD脈沖場電泳介紹第9頁脈沖場電泳（PFGE）原理 脈沖場凝脈電泳 (Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE),是近年發(fā)展起來一個主要分離大分子量線性DNA分子電泳技術(shù)。 普通瓊脂糖凝膠電泳分離DNA分子上限是50 kb 大于該極限D(zhuǎn)NA分子,常規(guī)瓊脂糖凝膠便失去了其分子篩作用,造成電泳帶型

5、無法分辨，PFGE創(chuàng)造恰好處理了這一問題。BIORAD脈沖場電泳介紹第10頁脈沖場電泳（PFGE）原理1984年, Schwartz和Cantor首次用此技術(shù)成功分離得到釀酒酵 母菌(Saccharomyces cerevisiae)細胞16條完整染色體DNA。今后,伴隨PFGE技術(shù)不停改進,現(xiàn)已含有分辨出高達10Mb級DNA能力。這一獨具高分辨力使PFGE應(yīng)用范圍已包括到幾乎全部生物基因組結(jié)構(gòu)研究。BIORAD脈沖場電泳介紹第11頁 PFGE基本原理是對瓊脂糖凝膠外加交變脈沖電場,其方向、時間和電流大小交替改變,每當電場方向發(fā)生改變時,大分子DNA便滯留在凝膠孔內(nèi),直至沿新電場軸重新定向后,

6、才能繼續(xù)向前泳動,DNA分子越大,這種重新定向需要時間就越長,當DNA分子改變方向時間小于脈沖時間時,DNA就能夠按照其分子量大小分開,經(jīng)EB染色后在凝膠上出現(xiàn)按DNA大小排列電泳帶型。 這種電泳技術(shù)促進了癌癥研究、食品安全、公共健康、品質(zhì)控制和基因組作圖進步。脈沖場電泳（PFGE）原理PFGE原理BIORAD脈沖場電泳介紹第12頁PFGE普通核酸電泳脈沖場電泳（PFGE）原理BIORAD脈沖場電泳介紹第13頁BIO-RAD 脈沖場電泳型號選擇 脈沖網(wǎng)試驗室使用BIO-RAD脈沖場電泳系統(tǒng)分離菌株DNA，電泳完成后凝膠用EB染色，然后用BIO-RAD分辨率更高成像儀采集和處理圖像，并制成TIF

7、F 格式，使用帶數(shù)據(jù)共享工具Fingerprinting 軟件或BioNumeric軟件進行分析。該模式成功地應(yīng)用于細菌性傳染疾病溯源及監(jiān)控。 BIORAD脈沖場電泳介紹第14頁CHEF-DR IIIBIORAD脈沖場電泳介紹第15頁脈沖場電泳系統(tǒng)配件BIORAD脈沖場電泳介紹第16頁脈沖場電泳（PFGE）試驗流程BIORAD脈沖場電泳介紹第17頁全部培養(yǎng)細胞用瓊脂糖包被，防止后續(xù)處理過程中DNA被剪切瓊脂糖和細胞混合物注入制樣模塊中， (1.5mm x 10mm x 5mm)，凝固后，膠塊能夠從制樣模塊中取出。（2）細胞壁裂解，蛋白消化Proteinase K膠塊在細胞裂解液和蛋白酶K溶液中

8、處理Agarose（1） 細胞包被DNACellular ProteinCell Wall制好膠塊，能夠在1天內(nèi)或4天中進行后續(xù)處理脈沖場電泳（PFGE）操作流程BIORAD脈沖場電泳介紹第18頁膠塊制備: 常規(guī)DNA制備方法得不到完整大分子量DNA,因為DNA大片段很脆弱,輕易因提取過程中機械作用如吸打、離心等而造成DNA斷裂。脈沖場電泳（PFGE）操作流程 為了得到完整大量DNA大片段,當前主要是采取低熔點瓊脂糖(Lowmelting point agarose)包埋樣品,再進行原位裂解和去蛋白處理從而釋放DNA。 低熔點瓊脂糖在這個過程中阻止了機械力對DNA大片段剪切作用,因而細胞裂解所

9、釋放DNA大片段包埋在膠塊中。制作好樣品插塊能夠在電泳時直接插入加樣孔中。BIORAD脈沖場電泳介紹第19頁（3） DNA酶切Rare Cutting Restriction Enzyme16hr 用不慣用限制性內(nèi)切酶消化DNA，產(chǎn)生15-20 條帶，能夠清楚判別亞型（4）上樣、電泳(Side view of agarose gel)脈沖場電泳（PFGE）操作流程BIORAD脈沖場電泳介紹第20頁脈沖場電泳（PFGE）操作流程BIORAD脈沖場電泳介紹第21頁（5） 染色，觀察結(jié)果(6) 結(jié)果分析DNA用EB 染色，在紫外下觀察結(jié)果。電泳條帶被凝膠圖象儀統(tǒng)計下來，能夠和數(shù)據(jù)庫資料做比較。 比較

10、結(jié)果能夠在不一樣試驗室之間共享。脈沖場電泳（PFGE）操作流程BIORAD脈沖場電泳介紹第22頁影響PFGE 結(jié)果原因影響PFGE試驗結(jié)果原因：脈沖角度（ Pulse / Reorientation Angle ）脈沖轉(zhuǎn)化時間和轉(zhuǎn)化速率（ Switch Time and Switch Time Ramping ）電壓梯度（ Voltage Gradient ）緩沖液類型、濃度和溫度（ Buffer Type, Concentration, and Temperature）瓊脂糖類型和濃度（ Agarose Type and Concentration ）運行時間（ Run Time ）脈沖場電

11、泳（PFGE）操作流程BIORAD脈沖場電泳介紹第23頁 PFGE含有獨特分離大片段DNA能力,是一個分析染色體DNA強有力工具。當前PFGE主要應(yīng)用于染色體DNA分離、微生物基因分型、DNA輻射損傷修復、細胞凋亡、酵母人工染色體電泳分析及單向電場泳難以分辨DNA圖譜制作等研究中。脈沖場電泳（PFGE）應(yīng)用BIORAD脈沖場電泳介紹第24頁脈沖場電泳（PFGE）應(yīng)用分子分型一、PFGE在分子分型方面應(yīng)用 經(jīng)過微生物分型能夠判定菌株是否一致、比較它們親緣關(guān)系,對于細菌性傳染病監(jiān)測、傳染源追蹤、傳輸路徑調(diào)查和識別有著非常主要意義。 傳統(tǒng)微生物分型技術(shù)主要是基于表型特征分類,如生化分型(biotyp

12、ing)、血清學分型(serotyping)、耐藥譜測定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌體分型(bacterialphage typing)等。因為微生物易受環(huán)境影響,很輕易改變其表示性狀,使得表型分類很不準確。 近年來伴隨分子生物學技術(shù)發(fā)展,基因分型技術(shù)日漸受到青睞。當代分子分型技術(shù)主要有:基于限制性內(nèi)切酶分型技術(shù):PFGE分型和RFLP分型;基于PCR分型技術(shù):RAPD分型、Rep-PCR分型、AFLP分型;基于核苷酸序列分析分型技術(shù):SLST分型和MLST分型。BIORAD脈沖場電泳介紹第25頁微生物表型分型與分子分型方法對比項目表型分

13、型分子分型方法依據(jù)表型特征遺傳特征方法舉例生物分型、血清分型、噬菌體分型、耐藥性分析質(zhì)粒分型、PFGE、核糖體分型、基于PCR方法、基于測序方法（MLST、VNTR、MLVA）優(yōu)點成熟可靠數(shù)據(jù)庫，作為初級分型仍在常規(guī)使用高分辨率，可重復性，易于標準化及自動化缺點低分辨率、不可重復，并不適適用于全部病原體缺乏病原體歷史數(shù)據(jù)、成本高1.表型和分子分型各有優(yōu)缺點；對于罕見血清型菌株，表型可發(fā)揮主要作用2.分子分型方法各有優(yōu)缺點，各有適用性，聯(lián)合使用是主流3.試驗方法和結(jié)果質(zhì)量確保是任何分析網(wǎng)絡(luò)最關(guān)鍵部分BIORAD脈沖場電泳介紹第26頁PFGE分型技術(shù)因其重復性好、分辯力強被譽為細菌分子分型技術(shù)“金

14、標準”,并推薦作為金黃色葡萄球菌等病原微生物分型標準技術(shù)。PFGE分型技術(shù)不足是:耗時,需要24 d樣品制備時間;設(shè)備價格昂貴；對分析大小相同片段分辨力不是很高。當前,美國PulseNet已創(chuàng)建病原菌PFGE圖譜數(shù)據(jù)庫,經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫中病原菌PFGE圖譜比較,能夠判斷菌株間染色體DNA相同程度。脈沖場電泳（PFGE）應(yīng)用分子分型BIORAD脈沖場電泳介紹第27頁脈沖場電泳（PFGE）應(yīng)用分子分型BIORAD脈沖場電泳介紹第28頁 Tenover等提出了相關(guān)PFGE圖譜與測定菌株相關(guān)性判別標準,依據(jù)電泳條帶可分為:如PFGE圖譜一致,說明為相同菌株;有13條帶差異說明菌株間有相近關(guān)系,且只有單基因

15、改變;46條帶差異說明菌株間可能有相近關(guān)系,表示出有2個獨立基因差異;如菌株間有6條或更多條帶差異,說明有3個或更多基因差異,視為無相關(guān)性。 該標準有一定不足。因為細菌高變異性,判斷是否是同一菌株時允許一定變異存在。Fred在解釋PFGE圖譜時提出85%以上條帶相同為相同菌株,50%以上條帶不相同為不一樣菌株。脈沖場電泳（PFGE）應(yīng)用分子分型BIORAD脈沖場電泳介紹第29頁PulseNet大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特菌、彎曲桿菌BIORAD脈沖場電泳介紹第30頁PulseNetBIORAD脈沖場電泳介紹第31頁PulseNetBIORAD脈沖場電泳介紹第32頁PulseNetBIO

16、RAD脈沖場電泳介紹第33頁PulseNetBIORAD脈沖場電泳介紹第34頁加強公共衛(wèi)生試驗室和流行病學合作（1）建立參比試驗室和流行病學之間常規(guī)和快速信息共享如每七天例會經(jīng)過試驗室支持針對暴發(fā)流行病學調(diào)查檢測流行病學調(diào)查假設(shè)樣本來自病人樣本高度懷疑致病源，如食物、水病原體分子分型共同討論，確定很好分型方法血清分型抗生素耐藥性分析分子分型，如脈沖場凝膠電泳（PFGE）BIORAD脈沖場電泳介紹第35頁建立試驗室質(zhì)量控制體系如外部質(zhì)量控制系統(tǒng)（EQAS）引入?yún)^(qū)域或WHO全球性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，如全球食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)Regional centers 區(qū)域中心EQAS of WHOs GFN Count

17、ry data bank 國家數(shù)據(jù)庫Electronic list serve 電子目錄服務(wù)器增強公共衛(wèi)生試驗室和流行病學合作（2）BIORAD脈沖場電泳介紹第36頁 基因組文庫是將細胞核DNA酶切或隨機打斷成一定大小片段，然后將全部片段隨機地連接到各種基因載體上，再轉(zhuǎn)移至適當宿主細胞中，經(jīng)過宿主細胞大量繁殖而形成各個片段無性繁殖系總集。大片段基因組文庫包含噬菌體、YAC、BAC、Cosmid和Fosmid等文庫，主要依據(jù)他們插入片段大小和構(gòu)建載體不一樣而進行分類。當前幾乎全部模式物種及許多主要瀕危物種都已建立了基因組文庫。 構(gòu)建基因組文庫也是全基因組測序中一項主要工作，建立不一樣長度插人片段

18、基因組文庫，為全基因組序列拼接組裝及基因組物理圖譜繪制提供必要條件。普通在De Novo全基因測序中應(yīng)用最多是插入片段為約100 KbBAC文庫和40 Kb左右大小插入片段Fosmid文庫，已經(jīng)有大量文件報道。構(gòu)建BAC或Fosmid文庫時，其插人片段長度都已超出普通電泳分離閾值，而PFGE技術(shù)應(yīng)用有效地處理了這一難題。脈沖場電泳應(yīng)用構(gòu)建基因組文庫中應(yīng)用BIORAD脈沖場電泳介紹第37頁文庫構(gòu)建中主要有以下幾個方面需要應(yīng)用到PFGE技術(shù)：特定長度DNA插入片段分離，已分離DNA插入片段大小判定，建庫質(zhì)量判定(包含大小及穩(wěn)定性判定)。圖1簡明演示了兩種文庫構(gòu)建流程及PFGE在其中應(yīng)用。脈沖場電泳

19、應(yīng)用構(gòu)建基因組文庫中應(yīng)用BIORAD脈沖場電泳介紹第38頁二、PFGE在DNA輻射損傷和修復研究中應(yīng)用 在電離輻射作用下,DNA分子將產(chǎn)生各種類型損傷,包含堿基損傷、DNA單鏈斷裂(SSB)和雙鏈斷裂(DSBs)、DNA-DNA交聯(lián)以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等。輻射生物效應(yīng)分子模型提出者Leenhouts和Chadwick認為,電離輻射誘發(fā)許多細胞效應(yīng)均與DNA雙鏈斷裂相關(guān),所以DSB及其修復一直是研究熱點。脈沖場電泳應(yīng)用DNA輻射損傷和修復BIORAD脈沖場電泳介紹第39頁早期研究DSB方法主要有粘彈性測量法、速度沉降法、中性濾膜洗脫法,這些方法穩(wěn)定性差,靈敏度低。伴隨PFGE出現(xiàn),輻射引發(fā)DN

20、A斷裂過程才得到了詳細研究。利用PFGE能夠測量DNA雙鏈斷裂后DSBs分布，研究輻射引發(fā)DNA斷裂片段釋放百分比(FAR)和DNA斷裂片段平均長度隨照射劑量改變規(guī)律。脈沖場電泳應(yīng)用DNA輻射損傷和修復BIORAD脈沖場電泳介紹第40頁脈沖場電泳應(yīng)用DNA輻射損傷和修復BIORAD脈沖場電泳介紹第41頁PFGE技術(shù)優(yōu)點在于靈敏度高,還能夠提供DSB片段大小信息,是檢測電離輻射所致DNA雙鏈斷裂及修復敏感方法。不過該方法只能對雙鏈斷裂是否作出判斷,不能對DSBs進行量化,同時對檢測低劑量輻射引發(fā)雙鏈斷裂無能為力。脈沖場電泳應(yīng)用DNA輻射損傷和修復BIORAD脈沖場電泳介紹第42頁三、PFGE在細胞凋亡研究中應(yīng)用 細胞凋亡(apopto-sis)又稱細胞程序性死亡(PCD),是在一定生理或病理條件下,為了更加好地適應(yīng)生存環(huán)境而采取一個由基因控制、細胞主動、有序死亡過程。因為細胞凋亡與胚胎發(fā)育、免疫耐受和許多疾病產(chǎn)生等方面有著極為親密關(guān)系,所以,細胞凋亡機理研究已成為生物學領(lǐng)域研究熱點之一。所以,凋亡檢測技術(shù)也顯得尤為主要。脈沖場電泳應(yīng)用細胞凋亡研究BIORAD脈沖場電泳介紹第43頁研究表明:凋亡細胞DNA降解呈分步進行,首先是核小體之間裂解,產(chǎn)生50300 kb大小大片段(HMW),隨即HMW片段深入分解成規(guī)則約18020