6種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1、6種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿 化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨 酸為例，其反應(yīng)式如下：NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 2NH3 +H2 SO4 一一（NH4 b SO4 （2）（NH4 ）2 SO4 +2NaOH2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 （3）反應(yīng)（1 ）、（2）在凱氏瓶?jī)?nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，k

2、2so4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定 則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以 625 即得。二、雙縮脲法（biuret法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲（NH3CONHCONH3 ）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180C左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在 強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的 肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨

3、基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定 蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸 等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度 差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。（二）試劑與器材1. 試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn) 蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量 凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱(chēng)量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

4、牛血清清蛋白 用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0. 05NaOH配制。（2）雙縮脲試劑:稱(chēng)以1.50克硫酸銅（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O64H2O）, 用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi) 壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2.器材：可見(jiàn)光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。（三）操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升

5、雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025C）下放置30分 鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值， 以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測(cè)定：取23個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度 不要超過(guò) 10mg/ml。三、folin酚試劑法（lowry法）（一）實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制 較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同 的，只是加入了第二種試劑，即folin酚試

6、劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種 顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin酚試劑中的 磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在 一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。folin酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng) 用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo) 準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易 干擾lowry反應(yīng)。而且對(duì)

7、后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘 油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙 醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。 含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則 必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加folin一酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性ph條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng) 只在ph=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin 一酚試劑加到堿性的銅一蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即

8、混勻，以便在磷 鉬酸一磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20250mg。二)試劑與器材1.試劑(1 )試劑甲：10克Na2CO3, 2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O64H2O)。溶解于500毫升蒸 餾水中。0.5克硫酸銅(CuSO45H2O)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份(a)與1份(b)混合，即為試劑甲。試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO42H2O) ,25克鉬酸鈉(Na2MOO42H2O)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫

9、升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小 火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰(Li2SO4)，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸 騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至 1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋?zhuān)s 加水1倍，使最終的酸濃度為1n左右。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱(chēng)取結(jié)晶牛血清清蛋白或g球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml 左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCI溶液。2.器材（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16 支（三）操

10、作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取 16 支大試管，1 支作空白，3 支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加 入0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升， 然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025C）放置10分鐘。再逐管 加入0.5毫升試劑乙（folin酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。 然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液 的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo),吸光度值為縱座標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線

11、。注意：因lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5 毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)， 1 分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲， 2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。 全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1 支試管可立即加入0.5毫升試劑乙， 1 分鐘后第2支試管 加入0.5毫升試劑乙， 2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘， 然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是 每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下

12、面兩排是計(jì)算出的每管 中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。folin酚試劑法實(shí)驗(yàn)表管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml）未知蛋白質(zhì) 0.2 0.4 0.6（約 250mg/ml）蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質(zhì)的量（mg）吸光度值（ a700）2.樣品的測(cè)定：取1 毫升樣品

13、溶液（其中約含蛋白質(zhì) 20250微克） ，按上述方法進(jìn)行操作，取1毫 升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn) 曲線測(cè)定的各試管后面，再增加 3個(gè)試管。如上表中的 8、9、10 試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因 而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。四、改良的簡(jiǎn)易folin 酚試劑法（一）試劑1試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5n NaOH、10%Na2CO3、0.1%

14、酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時(shí)注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最后加入。試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時(shí)加蒸餾水稀釋8 倍。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（二）操作步驟 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1 毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55C恒溫水浴中保溫5分鐘。用流動(dòng)水冷卻后，在660nm下測(cè)定其吸光度值。 改良的快速簡(jiǎn)易法，可獲得與folin酚試劑法（即lowry基本法）相接近的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（bradford法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲法（biuret法）和folin酚試劑法（lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍?/p>

15、質(zhì)溶液測(cè)定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法?？捡R斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由46 5nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特 別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值a595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。bradford 法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比lowr

16、y法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染 料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變 化比 lowry 法要大的多。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋 白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之 間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾lowry法的k+、Na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙 醇、 edta 等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是

17、：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定 時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、triton x-100、十二烷基硫酸鈉（s ds）和0.1n的NaOH。（如同0.1n的酸干擾lowary法一樣）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知 蛋白質(zhì)的濃度。(二)試劑與器材1.試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g球蛋白或牛血清清蛋白(bsa),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)溶

18、液?？捡R斯亮蘭g250染料試劑：稱(chēng)100mg考馬斯亮蘭g250,溶于50ml 95%的乙醇后，再 加入 120ml 85%的磷酸，用水稀釋至 1 升。2.器材：( 1 )可見(jiàn)光分光光度計(jì)( 2)旋渦混合器試管16支操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)方法取16支試管， 1 支作空白， 3 支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、 水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0. 1ml，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g250試劑，每加完一管, 立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈

19、，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見(jiàn)下表 中的第8、 9、 10管。加完試劑2-5分鐘后，即可開(kāi)始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1m卜2O加5.0mlg250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量 95% 的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡?？捡R斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10（1.0mg/ml）未知蛋白質(zhì) 0.02 0.04 0.06（

20、約 1.0mg/ml）蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04考馬斯亮藍(lán)g250 試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值（ a595 ）（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值a595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。2.微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10 100mg/ml），可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml

21、或1.0ml, 空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0ml H2O,考馬斯亮藍(lán)g250試劑仍加5.0ml，同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定 595nm 的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的 性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238n m的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可 以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽

22、，例如生化制備中 常用的（nh4）2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí) 只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì) 那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。 核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫 外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外

23、，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因 ph 的改變而有變化，因此要注意溶液的 p h 值，測(cè)定樣品時(shí)的 ph 要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 ph 相一致。下面介紹四種紫外吸收法：1.280nm 的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨 基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對(duì) 照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通 常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英

24、比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，a280約為1.0左右。由此可立即 計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值（a1%1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以 較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（a1%1cm ）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1 cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值a1%1cm,稱(chēng)為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度=（a28010 ）/ a1%1cm,280nm （mg/ml）（q 1% 濃度？10mg/ml）例：牛血清清蛋白： a1%1cm=6.3 （280nm）溶菌酶： a1%1cm=22.8 （280nm）若查不到待

25、測(cè)蛋白質(zhì)的 a1%1cm 值，則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 為牛血清清蛋白（bsa）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取6支試管，按下表編號(hào)并加入試劑：管號(hào) 1 2 3 4 5 6bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0a280用第1管為空白對(duì)照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度a280,以a280為縱座標(biāo)， 各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未 知樣品的a280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管a280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì) 濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的 a1%1cm,280nm2.280nm和260nm的吸收差法核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的 吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反， 280nm 紫外吸收值大于 260nm 的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：a280/a260- 1.8純核酸的光吸收