流式細胞儀培訓

1、流式細胞儀培訓第1頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五主要內容 流式細胞儀概述 流式細胞儀的工作原理 流式細胞儀的應用 檢測的一般步驟第2頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五 一、流式細胞儀概述 第3頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五流式細胞儀種類BD FACSVantageBD-Calibur Epics Altra第4頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五Epics Altra Beckman Coulter第5頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五流式細胞儀的定義 流式細胞儀是指，使細胞（或

2、其他粒子）以單個方式依次高速通過激發(fā)光束，采集細胞被光照時產生的各種信號，對信號進行處理，并對各參數進行關聯分析的一種儀器。第6頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五 利用流式細胞儀通過檢測熒光信號來檢測細胞或其它顆粒性物質（表面或胞漿或胞核）的物理、化學特性并通過這些特性對細胞或顆粒進行定量。 檢測表面標記物 檢測胞漿標記物 檢測胞核內標記物 檢測可溶性蛋白流式細胞術（FLOW CYTOMETRY）第7頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五流式細胞儀的基本結構前向散射側向散射第8頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五流式細胞儀顯微鏡流動的

3、細胞靜止的細胞樣本數量大數量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布可以揭示細胞內部結構信息特殊的顯微鏡第9頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五 高速測定細胞，大樣本計數 檢測稀有細胞 多參數分析 自動化 細胞分選流式細胞儀的主要特點第10頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五 二、流式細胞儀工作原理 第11頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五流式細胞儀工作原理流式細胞儀通常以激光作為激發(fā)光源，經過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號被光電二極管和光電倍增管接收，之后轉換

4、為電信號，再通過模/數轉換器，將連續(xù)的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號，最后由計算機進行計算處理。第12頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五儀器基本組成流路流動室 鞘液SHEATH 樣本流SAMPLE 單細胞懸液5105-1106個/ml光路光源濾片光電倍增管PMT HV電路放大電路HV及GAIN 增益A/D轉換統計 計算機第13頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五流路Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流動室第14頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星

5、期五流式細胞儀光路圖Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (PE)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流動室第15頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五激光配置488nm氬離子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器第16頁，共57頁，2022年，

6、5月20日，1點30分，星期五光路 - 濾片特性長通濾片 允許長于設定波長的光通過 短通濾片 允許短于設定波長的光通過 帶通濾片 允許一定帶寬的波長通過當以 45o 角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光 ，這種方式的濾片稱為二向色性濾片( dichroic filter)630 nm BandPass FilterWhite Light Source第17頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五光信號收集 光信號分離，導向，各探測通道PMT接收并轉化為電信號。二色鏡 1 2 3帶通濾波片光電倍增管激光束細胞收集透鏡前向散射光側向散射光，熒

7、光第18頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五數據處理FSC SSC FL1 FL2 FL3對數 線性 線性 線性 對數脈沖處理，模數轉換光信號電信號記錄數據，顯示結果（面積，峰高，寬度）第19頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五顆粒度細胞大小流式細胞儀產生的信號非熒光信號第20頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五FL1 FITC,GFP(PMT2)FL2 PE (PMT3)FL3 ECD,PI (PMT4)FL4 PC5,APC (PMT5)熒光信號第21頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五細胞表面的抗原(或細胞膜

8、受體)與相關的熒光抗體結合，形成帶有熒光的抗原抗體復合物。通過流式細胞儀測定其熒光量，即可得到細胞群的不同抗原位點表達情況。原理第22頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五488nm空冷激光 ： FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、 PerCP 、EGFP 、EYFP 、AO 、TO 、Fluo3633nm空冷激光： APC、APC-CY7 、CY5 90-4水冷激光：UV（333-364nm） HOECHST 33342、DAPI 第23頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五 三、流式細胞儀應用 第24頁，共57頁，2022年，5月20日，1點

9、30分，星期五流式細胞儀應用 淋巴細胞免疫功能測定 干細胞研究 細胞增殖與凋亡檢測 細胞周期及倍體分析 細胞活性分析 細胞分選 第25頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五淋巴細胞亞群活化的T淋巴細胞抗原特異性免疫細胞調控性T細胞樹突狀細胞先天免疫細胞細胞免疫功能測定第26頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五 細胞群 CD抗原 T細胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B細胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系細胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35

10、 NK細胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 內皮細胞 CD105 CD106 CD109 細胞因子受體 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126CD抗原及其相關細胞群第27頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五淋巴細胞亞群數量檢查項目和意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴重降低增高降低SARS

11、降低降低降低降低降低慢性活動性肝炎、肝硬化降低正?；蛟龈呓档徒档湍[瘤降低降低增高降低降低第28頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五用熒光標記抗體抗體特異性地結合細胞上對應的抗原表達該抗原的細胞被標記上熒光；抗原表達多的細胞熒光強度強陽性細胞百分比或濃度靶蛋白濃度第29頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五淋巴細胞CD抗原的流式細胞檢測第30頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五造血系統干細胞腫瘤干細胞間充質干細胞神經干細胞脂肪干細胞干細胞研究第31頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五熱門研究(腫瘤)干細胞腫瘤組織無限制

12、的增殖在于腫瘤干細胞的存在目前研究的腫瘤干細胞來源于前列腺、乳腺等腫瘤腫瘤干細胞數量稀少，常規(guī)方法很難檢測目前研究發(fā)現，腫瘤干細胞和正常細胞在HOECHEST 33342染料攝取方面有重大差別故流式細胞儀是分析和檢測腫瘤干細胞的重要工具第32頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五 干細胞能表達ABCG2泵蛋白，在HOECHST 33342染色時能將該染料泵出，因此分析不能被該染料染色的細胞群時可以發(fā)現一群不能染色的細胞既是干細胞，因此能夠在眾多腫瘤細胞中區(qū)分出腫瘤干細胞。腫瘤干細胞中的研究應用-Hoechst 33342 side population第33頁，共57頁，20

13、22年，5月20日，1點30分，星期五HoechstHoechst+Vera.Side Population Cells第34頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五細胞凋亡研究1. 鑒別凋亡與壞死: Annexin /PI2. 測定凋亡率:Annexin 、Apo 27、TUNEL3. 研究凋亡觸發(fā)機制：Caspase、Fas及FasL bcl-2/bax4. 多參數分析凋亡是趨勢第35頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五第36頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五G1S phaseG2MG112 1DNA含量 DNA 含量細胞周期時相G

14、0/1G2/MS細胞數細胞周期分析第37頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五PIEthidium BromideAcridine OrangeDAPI (UV excitable)Hoechst 33342 (viable, UV excitable)不能主動進入細胞，需要固定打孔488nm激發(fā)為脂溶性，主動進入細胞UV激發(fā)常用的DNA 染料第38頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五DNA含量及細胞周期分析 細胞周期分析:在細胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現出周期性的變化。通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行

15、分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細胞周期進行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.第39頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五G0/G1SG2/M第40頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五流式細胞儀分選電荷式分選是當前的主流分選模式高速分選是保證結果的基本條件高純度和高活性是分選的基本要求可選的激光要多樣化（空冷、水冷、固體；不同的波長；真正的紫外）提供多種分選流動室光路穩(wěn)定，紫外激光功率大流式分選和磁

16、珠分選的差別和聯系第41頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector電荷式細胞分選第42頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五細胞分選的主要技術指標 分選速度： 25000個細胞/秒 分選純度：98% 分選后細胞存活率：97%第43頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五Before SortingAfter Sorting第44頁，共57頁，2022年，5月20

17、日，1點30分，星期五 三、流式細胞儀檢測的一般步驟 第45頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五設置檢測方案（PROTOCOL)染色標本（同型對照，補償管，檢測抗體）同型對照管調電壓電壓不變，補償管調補償電壓不變，補償不變，上檢測管檢測后直接閱讀結果檢測的一般步驟第46頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五電壓調節(jié)利用同型對照：設置背景電壓 volts增益 Gain設定陰性和陽性信號強度的臨界點第47頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五熒光補償 Need to do when we measure signals from more t

18、han 1 fluorescence. FITC520BPPE575BP第48頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5第49頁，共57頁，2022年，5月20日，1點30分，星期五補 償PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC signal - % PE signalAfter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensation第50頁，共57頁，2022年，5月