藥典三部(2015版)通則支原體檢查法

1、精選文檔3301支原體檢查法主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、比較細胞以及臨床治療用細胞進行支原體檢查時，應(yīng)同時進行培育法和指示細胞培育法（DNA染色法）。病毒類疫苗的病毒收獲液、原液采納培育法檢查支原體，必需時，亦可采納指示細胞培育法挑選培育基。也可采納經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)認同的其余方法。第一法培育法介紹培育基及其處方支原體液體培育基支原體肉湯培育基豬胃消化液500ml氯化鈉2.5g牛肉浸液（12）500ml葡萄糖5.0g酵母浸粉5.0g酚紅0.02gpH值7.60.2。于121滅菌15分鐘精氨酸支原體肉湯培育基豬胃消化液500ml葡萄糖1.0g牛肉浸液（12）500mlL-精氨酸2.0g酵母

2、浸粉5.0g酚紅0.02g氯化鈉2.5gpH值7.10.2。于121滅菌15分鐘支原體半流體培育基按項處方配制，培育基中不加酚紅，加入瓊脂2.53.0g。支原體瓊脂培育基按項處方配制，培育基中不加酚紅，加入瓊脂13.015.0g。除上述介紹培育基外，亦可使用可支持支原體生長的其余培育基，但敏捷度一定切合要求。培育基敏捷度檢查（變色單位試驗法）菌種肺炎支原體（ATCC15531株）、口腔支原體（ATCC23714株），由國家藥品檢定機構(gòu)散發(fā)。操作將菌種接于適合的支原體培育基中，經(jīng)361培育至培育基變色，盲傳兩代后，將培育物接種至待檢培育基中，做10倍系列稀釋，肺炎支原.精選文檔體稀釋至10-71

3、0-9，接種在支原體肉湯培育基內(nèi)；口腔支原體稀釋至10-310-5，接種在精氨酸支原體肉湯培育基內(nèi)。每個稀釋度接種3支試管，置361培養(yǎng)714天，察看培育基變色結(jié)果。結(jié)果判斷以接種后培育基管數(shù)的2/3以上體現(xiàn)變色的最高稀釋度為該培育基的敏捷度。液體培育基的敏捷度：肺炎支原體（ATCC15531株）應(yīng)達到10-8，口腔支原體（ATCC23714株）應(yīng)達到10-4。檢查法供試品如在分裝后24小時之內(nèi)進行支原體檢查可儲存于28；超出24小時應(yīng)置-20以下儲存。檢查支原體采納支原體液體培育基和支原體半流體培育基（或支原體瓊脂培育基）。半流體培育基（或瓊脂培育基）在使用前應(yīng)煮沸1015分鐘，冷卻至56左

4、右，而后加入滅能小牛血清（培育基血清為82），并可酌情加入適當青霉素，充分搖勻。液體培育基除無需煮沸外，使用前亦應(yīng)相同補加上述成分。取每支裝量為10ml的支原體液體培育基各4支、相應(yīng)的支原體半流體培育基各2支（已冷卻至361），每支培育基接種供試品0.51.0ml，置361培育21天。于接種后的第7天從4支支原體液體培育基中各取2支進行代次培養(yǎng)，每支培育基分別轉(zhuǎn)種至相應(yīng)的支原體半流體培育基及支原體液體培育基各2支，置361培育21天，每隔3天察看1次。結(jié)果判斷培育結(jié)束時，如接種供試品的培育基均無支原體生長，則供試品判為合格；如疑有支原體生長，可取加倍量供試品復(fù)試，如無支原體生長，供試品判為合格

5、，如仍有支原體生長，則供試品判為不合格?！靖阶ⅰ抠|(zhì)量檢定部門應(yīng)會同培育基制造部門按期抽檢支原體培育基敏捷度。第二法指示細胞培育法（DNA染色法）將供試品接種于指示細胞（無污染的Vero細胞或經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)認同的其余細胞）中培育后，用特異熒光染料染色。如供試品污染支原體，在熒光顯微鏡下可見附在細胞表面的支原體DNA著色。試劑二苯甲酰胺熒光染料（Hoechst33258）濃縮液稱取二苯甲酰胺.精選文檔熒光染料5mg，加入100ml不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks均衡鹽溶液中，在室溫用磁力攪拌3040分鐘，使完整溶解，-20避光保留。二苯甲酰胺熒光染料工作液無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks溶液100m

6、l中加入二苯甲酰胺熒光染料濃縮液1ml，混勻。固定液乙酸甲醇（13）混淆溶液。封片液量取0.1ml/L枸櫞酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液27.8ml、甘油50.0ml混勻，調(diào)pH至5.5。培育基及指示細胞DMEM完整培育基。DMEM無抗生素培育基。指示細胞（已證明無支原體污染的Vero細胞或其余傳代細胞）取培育的Vero細胞經(jīng)消化后，制成每1ml含105的細胞懸液，以每孔0.5ml接種6孔細胞培育板或其余容器，每空再加無抗生素培育基3ml，于5%二氧化碳孵箱361培育留宿，備用。供試品辦理細胞培育物將供試品經(jīng)無抗生素培育液起碼傳一代，然后取細胞已長滿的且3天未換液的細胞培育

7、上清液待檢。毒種懸液如該毒種對指示細胞可形成病變并影響結(jié)果判準時，應(yīng)用對支原體無克制作用的特異抗血清中和病毒后或用不產(chǎn)生細胞病變的另一種指示細胞進行檢查。其余供試品檢查時所采納的指示細胞應(yīng)為該供試品對其生長無影響的細胞。測定法于制備好的指示細胞培育板中加入供試品（細胞培育上清液）2ml（毒種或其余供試品起碼1ml），置5%二氧化碳孵箱361培育35天。指示細胞培育物起碼傳代1次，末代傳代培育用含蓋玻片的6孔培育板培育35天，吸出培育孔中的培育液，加入固定液5ml，擱置5分鐘，吸出固定液，再加入5ml固定液固定10分鐘，吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干燥，加二苯甲酰胺熒光染料（或其余DNA染料）工作液5ml，加蓋，室溫擱置30分鐘，吸出染液，每孔用水5ml洗3次，吸出水，蓋玻片于空氣中干燥，取干凈載玻片加封片液1滴，分別將蓋玻片面向下蓋在封片液上制成封片。用熒光顯微鏡察看。用無抗生素培育基2ml代替供試品，同法操作，作為陰性比較。.精選文檔用已知陽性的供試品標準菌株2ml代替供試品，同法操作，作為陽性比較。結(jié)果判斷陰性比較僅見指示細胞的