雙波長(zhǎng)差吸光度法后分光技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展前景

1、雙波長(zhǎng)差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠(yuǎn)景(精)雙波長(zhǎng)差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠(yuǎn)景(精)9/9雙波長(zhǎng)差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠(yuǎn)景(精)雙波長(zhǎng)差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠(yuǎn)景李雪志(本文1996年宣布成立在Lambertbeer定律基礎(chǔ)上的單波長(zhǎng)分光光度分析技術(shù),應(yīng)用極為廣泛,但因?yàn)閱尾ㄩL(zhǎng)法存在污濁試樣對(duì)光的散射和比色杯背景汲取等難以戰(zhàn)勝的弊端,它在高精度丈量中的應(yīng)用遇到必然的限制。為認(rèn)識(shí)決污濁試樣對(duì)分光光度測(cè)定的干擾問(wèn)題,美國(guó)的B.Chance于1951年制成了用振動(dòng)鏡使兩束不同樣波長(zhǎng)的單色光交替經(jīng)過(guò)待測(cè)溶液的雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)(DoubleWavelengthSpe

2、ctrophotometer從,而確立了雙波長(zhǎng)分光光度法的基礎(chǔ)。跟著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,雙波長(zhǎng)分光光度分析技術(shù)已日臻圓滿,與先進(jìn)的后分光技術(shù)相聯(lián)合,在生化自動(dòng)化分析中獲取了廣泛的應(yīng)用并顯示出了光明的發(fā)展遠(yuǎn)景。雙波長(zhǎng)分光光度法的原理雙波長(zhǎng)分光光度法是在傳統(tǒng)分光光度法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,它的理論基礎(chǔ)是差吸光度和等汲取波長(zhǎng)。它與傳統(tǒng)分光光度法的不同樣之處,在于它采納了兩個(gè)不同樣的波長(zhǎng)即丈量波長(zhǎng)(又叫主波長(zhǎng)p,PrimaryWavelength和參比波長(zhǎng)(又叫次波長(zhǎng)s,SecondWavelength同時(shí)測(cè)定一個(gè)樣品溶液1,2,以戰(zhàn)勝單波長(zhǎng)測(cè)定的弊端,提升了測(cè)定結(jié)果的精巧度和正確度。初期的雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)

3、在測(cè)準(zhǔn)時(shí),兩束不同樣波長(zhǎng)的單色光經(jīng)斬光器(Chopper,一種用于雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)中使光束按必然周期反射,遮斷或經(jīng)過(guò)的裝置辦理后,以必然的時(shí)間間隔交替照耀1比色杯,經(jīng)待測(cè)溶液汲取后,再照到光電管上,產(chǎn)生兩個(gè)不同樣的吸光度,再將這兩個(gè)吸光度相減,就獲取了差吸光度A。依據(jù)Lamber-Beer定律,得:Ap=pLC+Ap(1As=sLC+As(2式中:A、pAs分別為待測(cè)溶液在主波長(zhǎng)和次波優(yōu)點(diǎn)的吸光度、p分s別為待測(cè)溶液在主波長(zhǎng)和次波優(yōu)點(diǎn)的摩爾吸光系數(shù):光徑:待測(cè)溶液的濃度Ap、As:分別為待測(cè)溶液在主波長(zhǎng)和次波優(yōu)點(diǎn)的散射或背景汲取當(dāng)p、s相差不太大時(shí),由同一待測(cè)溶液產(chǎn)生的光散射吸光度和背景吸光度

4、大概相等,即Ap=As,將(1式-(2式得:A-pAs=A=(-psLC(3關(guān)于同一待測(cè)溶液來(lái)說(shuō),-p是s一常數(shù)K,在光徑L不變的狀況下,(3式可簡(jiǎn)化為:A=KC(4(4式說(shuō)明,待測(cè)溶液在p與s兩個(gè)波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定的差吸光度A與試樣中待測(cè)物質(zhì)的濃度C成正比。這就是雙波長(zhǎng)法賴以成立的定量公式1,3。雙波長(zhǎng)差吸光度法擁有能夠戰(zhàn)勝溶液污濁的影響、共存組分汲取譜線疊加的攪亂,以及減少比色杯的光學(xué)不均一等優(yōu)點(diǎn)。它的差吸光度在2.5之內(nèi)時(shí),線性范圍優(yōu)秀。2選擇雙波長(zhǎng)的方法1,3雙波長(zhǎng)差吸光度只管有好多優(yōu)點(diǎn),但是怎樣正確選擇雙波長(zhǎng),則是應(yīng)用的重點(diǎn)。選擇雙波長(zhǎng)常用的方法有三種:2.1依據(jù)待測(cè)溶液對(duì)吸光譜的汲取曲線,

5、選擇最大汲取峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為p吸,收曲線下端較為平坦的某一波長(zhǎng)為s。2.2選待測(cè)溶液囁大汲取峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為p選,等汲取點(diǎn)的長(zhǎng)為s。所謂等汲取點(diǎn),是指關(guān)于某個(gè)波長(zhǎng),只管待測(cè)溶液的濃度不同樣,但對(duì)該波長(zhǎng)的光的汲取均相等。等汲取點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)叫做等汲取波長(zhǎng)。關(guān)于汲取光譜擁有汲取峰的物質(zhì),同濃度下吸光度相等的兩個(gè)波長(zhǎng),也是等汲取波長(zhǎng)。等汲取波長(zhǎng)是雙波長(zhǎng)法的理論基礎(chǔ)之一。應(yīng)用這一方法的必需條件是能正確地測(cè)定出等汲取點(diǎn),不然將造成明顯的偏差。2.3選溶液最大汲取峰的波長(zhǎng)為p,選顯色劑的最大汲取峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為s。該法又稱為雙波長(zhǎng)增敏法,它的原理是:當(dāng)向必然濃度的顯色劑溶液中加入待測(cè)物時(shí),因?yàn)樯晌镔|(zhì)濃度的增大

6、,生成物的吸光度也隨之增大,而顯色劑則因?yàn)椴煌：馁M(fèi),其吸光度漸漸減小。假如以p為測(cè)定波長(zhǎng),s為參比波長(zhǎng)時(shí),測(cè)得的差汲取光度明顯是生成物吸光度與耗費(fèi)的顯色劑的吸光度之和,進(jìn)而提升了測(cè)定的敏捷度。由上述方法能夠看出,雙波長(zhǎng)法選擇主波長(zhǎng)的原理與單波長(zhǎng)法同樣:均選擇待測(cè)溶液最大汲取峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng),所不同樣的是雙波長(zhǎng)法還應(yīng)依據(jù)不同樣條件選擇次波長(zhǎng)。文件指出1,影響雙波長(zhǎng)法測(cè)定精巧度的要素是:光輻射噪聲,電源不穩(wěn)和讀出噪聲,采納強(qiáng)光源能夠改良測(cè)定的精巧度。當(dāng)試樣中含有攪亂物質(zhì)時(shí),因?yàn)殡p波長(zhǎng)法減少了樣品的形式偏差,故測(cè)定的精巧度優(yōu)于單波長(zhǎng)法。影響雙波長(zhǎng)法正確度的要素是:由化學(xué)攪亂物惹起的偏差,但這類偏差要比單

7、波長(zhǎng)法小得多;由物理攪亂惹起的偏差,但能夠經(jīng)過(guò)采納較小的雙波長(zhǎng)差等方法來(lái)減少偏差,并且這類偏差自己就比單波長(zhǎng)法更小;由儀器的非理想性如比色杯的性質(zhì)和地點(diǎn),以及信號(hào)失調(diào)、狹縫過(guò)大和雜散光等惹起的偏差,此中尤此后者惹起的偏差為大,所以要求儀器的波長(zhǎng)精度在高并且盡量減少雜散光。后分光技術(shù)及其在儀器上的應(yīng)用現(xiàn)代的全自動(dòng)化分析儀因?yàn)槎囗?xiàng)目同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的需要,對(duì)分光光度計(jì)作了革命性的改造,并產(chǎn)生了后分光技術(shù)的見解,進(jìn)而使雙波長(zhǎng)分光光計(jì)光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)造變得較為簡(jiǎn)單并且與單波長(zhǎng)分光光度計(jì)有很大的差別。所謂后分光技術(shù)是相對(duì)傳統(tǒng)的分光光度計(jì)而言的。盡人皆知,光電比色法賴以成立的Lambert-Beer定律只適用于單

8、色光,單色光純度越高則測(cè)定結(jié)果的精巧度和正確度越好,假如用混淆光比色,則溶液的吸光度與液層厚度和溶液濃度間不可以比率關(guān)系。所以,傳統(tǒng)的分光光度計(jì)是以單色器(棱鏡或光柵對(duì)入射光進(jìn)行分光,此后使特定波長(zhǎng)的單色光經(jīng)過(guò)待測(cè)溶液進(jìn)行比色測(cè)定,而現(xiàn)代生化分析儀上采納所謂后分光技術(shù)的分光光度計(jì)則是直接以光源燈所發(fā)出的混淆光透過(guò)待測(cè)溶液,經(jīng)溶液汲取后再用全息光柵(HolographicGrating,是當(dāng)前最高等的分光器件,它既能夠簡(jiǎn)化光路,又能夠減少雜散光,由它色散后投射到二極管矩陣上的光譜焦平面的波長(zhǎng)精度在2nm之內(nèi)6對(duì)出射光進(jìn)行分光,此后將純度很高的不同樣波長(zhǎng)的單色光折射到光電二極管矩陣(Photodi

9、odeArray上,因?yàn)榈攸c(diǎn)不同樣,矩陣上的每一個(gè)光電二極管只好接收某個(gè)特定波長(zhǎng)的單色光。有人據(jù)此以為這各種類的分析儀但是用某幾個(gè)波長(zhǎng)的濾光板,光不純,波長(zhǎng)精度差,其實(shí)這是一種誤會(huì)。這類儀器在編制程序時(shí)(廠家或用戶已開初設(shè)定好某項(xiàng)試驗(yàn)采納某個(gè)波長(zhǎng),儀器工作時(shí)在微機(jī)的控制下只接收所選波長(zhǎng)的光電管上產(chǎn)生的電信號(hào)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的吸光度。當(dāng)前的大部分生化分析儀的二極管矩陣都有7到10個(gè)光電二極管,包括了從340nm700nm范圍內(nèi)常用的710個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)4,5,有的分析儀(如美國(guó)雅培企業(yè)的EPX、SPECTRUM、CCX系列甚至多達(dá)16個(gè)波長(zhǎng)。因?yàn)楝F(xiàn)代生化分析儀采納凹面全息光柵為后分光器件,進(jìn)而撤消了

10、斬光器。使雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)的構(gòu)造變得相對(duì)簡(jiǎn)單,并且更加重點(diǎn)的是,采納這類構(gòu)造的后分光技術(shù)使生化分析儀上多頂目同時(shí)測(cè)定變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。不然,假如仍按傳統(tǒng)分光光度計(jì)同樣以單色光進(jìn)行比色測(cè)定,為適應(yīng)不同樣頂目在短時(shí)間內(nèi)用不同樣波長(zhǎng)比色的需要,分光器件必然在幾秒甚至更短的時(shí)間內(nèi)屢次地改動(dòng)反射鏡的地點(diǎn),這關(guān)于機(jī)械來(lái)說(shuō)是難以辦到的,即便制成也會(huì)易于破壞而缺少適用價(jià)值。后分光技術(shù)的成立使上述問(wèn)題水到渠成,并且使雙波長(zhǎng)分光光度法變得更加適用。雙波長(zhǎng)法及后分光技術(shù)的現(xiàn)狀和遠(yuǎn)景雙波長(zhǎng)法自成立到現(xiàn)在已有四十多年的歷史,各樣通用型雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)在外國(guó)應(yīng)用已相當(dāng)廣泛,但國(guó)產(chǎn)的分光光度計(jì)仍以單波長(zhǎng)法為主。國(guó)內(nèi)有人依據(jù)雙波長(zhǎng)法

11、的基本源理,敷衍了事,利用一般的單波長(zhǎng)分光光度計(jì)(如721型成立雙波長(zhǎng)測(cè)定法,即先用某一波長(zhǎng)比色,記錄吸光度,再用另一波長(zhǎng)比色后記錄另一吸光度,此后按雙波長(zhǎng)法進(jìn)行計(jì)算,獲取了較滿意的結(jié)果。最近幾年來(lái),應(yīng)用雙波長(zhǎng)法并聯(lián)合后分光技術(shù)的全自動(dòng)生化分析儀已大批引進(jìn)到國(guó)內(nèi),但除了廠家供給的雙波長(zhǎng)數(shù)據(jù)外,好多人在儀器上自行編制試驗(yàn)程序時(shí)對(duì)次波長(zhǎng)選擇的重要性常常認(rèn)識(shí)不足,擁有較大的任意性,由此造成試驗(yàn)結(jié)果偏差還不知原由所在,所以有必需增強(qiáng)對(duì)雙波長(zhǎng)法和后分光技術(shù)的認(rèn)識(shí)。但能夠預(yù)示,跟著外國(guó)先進(jìn)儀器的引進(jìn)以及國(guó)產(chǎn)雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)漸漸進(jìn)入市場(chǎng),這一新技術(shù)必然為愈來(lái)愈多的人所認(rèn)識(shí)和接受,并在醫(yī)學(xué)查驗(yàn)領(lǐng)域獲取廣泛的應(yīng)用。參照文件王叔仁,等。雙波長(zhǎng)分光光度法.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)第一版,1986.葉應(yīng)嫵,等主編.臨床實(shí)驗(yàn)診療學(xué)(上.北京:人民衛(wèi)生第一版社,1989:137.黃尊波,等.雙波長(zhǎng)分光光度法在醫(yī)學(xué)查驗(yàn)上的應(yīng)用.中華醫(yī)學(xué)查驗(yàn)雜志,1981,4(3:185.ServiceReferenceManualof550Ex