二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

1、二代測(cè)序（WGS&WES）文庫(kù)構(gòu)建流程介紹韓麗萍.4.121/25目錄01 基本概念介紹04 疑問(wèn)與討論02 基礎(chǔ)文庫(kù)構(gòu)建WGS文庫(kù)&WES預(yù)文庫(kù)03 雜交捕捉技術(shù)WES文庫(kù)2/2501基本概念介紹3/25基本概念介紹全基因組重測(cè)序（ Whole-Genome sequencing, WGS ）是對(duì)已知基因組序列物種進(jìn)行不一樣個(gè)體基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。外顯子組測(cè)序（ Whole-exome sequencing, WES ）是利用設(shè)計(jì)好探針將坐標(biāo)已知全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后，進(jìn)行高通量測(cè)序基因組分析方法。對(duì)于人類基因組來(lái)說(shuō)，外顯子區(qū)域大約占到基因組1%

2、，大約在30M左右。普通WES測(cè)序深度為50X200X，詳細(xì)深度依研究目標(biāo)而定，其中個(gè)體之間變異程度較WGS小。4/25Reads in IGVIntegrative Genomics Viewer(IGV) 是一款針對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化專業(yè)軟件。它支持各種數(shù)據(jù)類型，包含基于芯片測(cè)序、二代測(cè)序和基因組注釋數(shù)據(jù)等。能夠幫助用戶對(duì)分析結(jié)果中相關(guān)文件在可視化條件下進(jìn)行瀏覽分析。5/2502基礎(chǔ)文庫(kù)構(gòu)建6/25文庫(kù)分子模型隨機(jī)打斷DNA末端修復(fù)3端加A（dATP）加接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)檢7/25隨機(jī)打斷WGS:300-400bpWES:150-250bp隨機(jī)打斷DNA末端修復(fù)3端加A（dATP）

3、加接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)檢8/25隨機(jī)打斷DNA末端修復(fù)3端加A（dATP）加接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)檢末端修復(fù)5末端磷酸化5533PP聚合補(bǔ)平55335533外切削平553355339/25隨機(jī)打斷DNA末端修復(fù)3端加A（dATP）加接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)檢5533PP5533AAPP加A10/25隨機(jī)打斷DNA末端修復(fù)3端加A（dATP）加接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)檢Indexed AdaptorGeneral Adaptor11/25隨機(jī)打斷DNA末端修復(fù)3端加A（dATP）加接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)檢擴(kuò)增擴(kuò)增P5、P7引物P5端通用引物（一個(gè)）P7端含有index引物（各種）經(jīng)過(guò)加接頭引入index經(jīng)過(guò)

4、PCR擴(kuò)增引入index12/25隨機(jī)打斷DNA末端修復(fù)3端加A（dATP）加接頭PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)檢末端修復(fù)3端加A（dATP）加接頭PCR擴(kuò)增On PCR13/25磁珠純化與片段分選片段分選第二步去掉小片段片段分選第一步去掉大片段14/2503雜交捕捉技術(shù)15/25液相雜交捕捉技術(shù)介紹利用寡核苷酸序列合成技術(shù)，合成大量生物素標(biāo)識(shí)RNA/DNA“誘餌”，利用堿基配對(duì)原理，經(jīng)過(guò)生物素與鏈霉親和素結(jié)合將目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集技術(shù)。慣用液相雜交捕捉試劑主要有Agilent、Roche和illumina，國(guó)內(nèi)主要是艾吉泰康。16/25 封閉與雜交：（預(yù)文庫(kù)/Blocking oligos） + 雜交捕捉液/

5、生物素標(biāo)識(shí)探針/RNAase抑制劑 。95度變性解鏈，65度退火復(fù)性，雜交16-24h。生物素標(biāo)識(shí)探針（RNA, 120nt）Cot-1 blocker接頭 blocker外顯子Cot-1重復(fù)序列接頭 封閉與雜交捕獲和洗脫P(yáng)CR擴(kuò)增富集文庫(kù)質(zhì)檢17/25 捕捉與洗脫1、磁珠上鏈霉親和素與探針上生物素結(jié)合（常溫反應(yīng)30min）。封閉與雜交捕獲和洗脫P(yáng)CR擴(kuò)增富集文庫(kù)質(zhì)檢18/25Complex 捕捉與洗脫2、含有Complex離心管放置到磁力架上等液體澄清以后，將上清去除即可去除多出或未利用“Blocking oligos、生物素標(biāo)識(shí)探針”以及“雜交捕捉液”。3、 65度條件下進(jìn)行洗脫，去除非特異性片段。19/25封閉與雜交捕獲和洗脫P(yáng)CR擴(kuò)增富集文庫(kù)質(zhì)檢20/25雜交、捕捉與擴(kuò)增-121/25雜交、捕捉與擴(kuò)增-222/25雜交、捕捉與擴(kuò)增-